一、肝细胞癌端粒酶活性检测及其临床应用价值（论文文献综述）
朱晓燃[1]（2021）在《清肝化瘀颗粒对原发性肝癌大鼠的治疗作用及主要成分对肝癌细胞增殖凋亡的影响》文中研究表明背景与目的清肝化瘀颗粒是基于姚树坤教授结合中医理论与多年临证经验总结的清肝化瘀方,经完善优化后的现代制剂技术制备而成的颗粒制剂（课题来源于“十二五”“重大新药创制”科技重大专项和北京市科委G20 工程创新研究）,以清热解毒、破瘀散结、健脾益气为治则治法,可针对大多数肝癌患者的证型。前期临床研究与基础实验证实,清肝化瘀方对缓解肝癌患者临床症状、改善生存质量、延长生存期以及提高免疫功能方面具有显着作用,并可以通过多靶点分子,多信号通路对肝癌的多种细胞生物学行为进行调节,深入开发研究价值。苦参是本研究清肝化瘀颗粒的君药之一,其提取物苦参碱单体明确,药理作用广泛,也是清肝化瘀颗粒的主要组分。因此本研究的目的是观察清肝化瘀颗粒对原发性肝癌（Primary liver carcinoma）大鼠的治疗作用,评价其药效学,通过体内凋亡实验和体外细胞实验,初步探究其靶点及作用机制,为临床推广提供理论依据。方法:SPF级雄性6周龄大鼠192只,适应性饲养5天后,造模组（n=180）采用改良后的造模方法,使用二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine,DEN）诱导肝癌,空白组（n=12）给予等体积生理盐水,取材观察肝脏成癌率>80%时开始干预。将造模组大鼠162只（除去死亡3只和观察不同时间成癌率15只）随机分为模型组、清肝化瘀颗粒低剂量组、清肝化瘀颗粒高剂量组、清肝化瘀颗粒高剂量组、肝复乐组和氟尿嘧啶组,每组各27只。清肝化瘀颗粒低、中、高剂量组分别灌胃清肝化瘀颗粒0.47g/kg、0.93g/kg、1.86g/kg,肝复乐组灌胃肝复乐胶囊0.94g/kg,模型组以10ml/kg灌胃等体积生理盐水,氟尿嘧啶组给予氟尿嘧啶注射液20mg/kg腹腔注射,连续给药8周,于末次给药后每组随机选取6只解剖取材。观察指标包括:造模情况及各组大鼠肝脏大体情况、生存期、肝指数、脾指数及肝脏病理组织变化;丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate transaminase,AST）、总胆红素（Total bilirubin,TBIL）、γ-谷氨酰转肽酶（Glutamyl transpeptidase,GGT）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）、α-L-岩藻糖苷酶（Alpha-L-fucosidase,AFU）等肝功能指标;肝癌特异性标志物甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）;通过流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群;原位末端转移酶标记技术（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL）法检测肝癌组织细胞凋亡情况,免疫组化法检测肝癌组织中Caspase-3的表达。选择清肝化瘀颗粒主要成分苦参碱进行体外细胞实验,用CCK8法（cell counting kit-8）检测苦参碱对人肝癌细胞HepG2细胞的增殖抑制作用,筛选出IC50;定量聚合酶链式反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction,QPCR）检测苦参碱对 HepG2 细胞中 Bax、Bcl-2、P53、Beclinl的基因表达的影响。结果1 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠的治疗作用1.1 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠肝脏大体、肝脾指数及生存期的作用①肝脏表面癌结节数:与模型组比较,清肝化瘀颗粒中剂量组、高剂量组和氟尿嘧啶组肝脏表面癌结节数均显着降低。②肝、脾指数:与模型组比较,清肝化瘀颗粒低剂量组、中剂量组和高剂量组、肝复乐组及氟尿嘧啶组的大鼠肝指数均显着降低,且清肝化瘀颗粒低剂量组和氟尿嘧啶组的脾指数亦显着降低。③生存期:给药干预8周后,上述各组 PLC 大鼠的存活率分别为 47.62%、52.38%、71.43%、66.67%、52.38%和 85.71%,中位生存期分别为55d、59d、66d、71d、58d和73d。与模型组相比,清肝化瘀颗粒中、高剂量组和氟尿嘧啶组生存期显着延长;与肝复乐组比较,清肝化瘀颗粒高剂量组的生存期显着延长。1.2 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠肿瘤标志物AFP的下调作用与模型组比较,清肝化瘀颗粒低剂量、中剂量、高剂量组、肝复乐组和氟尿嘧啶组大鼠的AFP水平均显着下降;随着清肝化瘀颗粒组给药剂量的增加,AFP水平呈递减趋势,且清肝化瘀颗粒高剂量组与低剂量组间差异显着。1.3 清肝化瘀颗粒缓解PLC大鼠肝损伤,改善其肝功能的作用与模型组比较,清肝化瘀颗粒高剂量组、氟尿嘧啶组可显着下调AST水平,清肝化瘀颗粒低剂量、中剂量、高剂量组和氟尿嘧啶组均可显着下调血清GGT、AFU、TBIL水平,清肝化瘀颗粒中剂量、高剂量组和氟尿嘧啶组亦可显着下调ALP水平。1.4 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠外周血T淋巴细胞的调节作用与模型组比较,清肝化瘀颗粒低剂量、中剂量、高剂量组的CD4+细胞数显着上升,CD8+细胞数显着下降,CD4+/CD8+的比率显着升高。2清肝化瘀颗粒对PLC大鼠肝癌细胞凋亡的影响与模型组相比,清肝化瘀颗粒组的PLC大鼠发生肝癌凋亡的肝癌细胞数量和比例明显增加,Caspase-3在清肝化瘀颗粒剂量组、肝复乐组和氟尿嘧啶组显着表达,且清肝化瘀颗粒低剂量、中剂量、高剂量组间Caspase-3的表达差异显着。3苦参碱对人肝癌细胞HepG2细胞增殖抑制的影响①苦参碱对HepG2细胞活性的影响苦参碱干预24-72小时,HepG2细胞活性显着下降,且苦参碱对肝癌细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性。给药24h、48h、72h后,IC50分别为2.116mg/mL、0.989mg/mL和 1.121mg/mL。②苦参碱以0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL干预HepG2细胞48h,与对照组比较,HepG2细胞Beclin1的表达水平显着下降,且呈浓度依赖性,Bcl-2的表达水平呈不同程度的下降,1.5mg/mL苦参碱可显着下调Bcl-2的表达水平,Bax和P53的表达水平较对照组均有不同程度上升。结论:清热解毒、破瘀散结、健脾益气的清肝化瘀颗粒可有效达到对PLC大鼠的治疗作用,显着延长生存期,其机制可能与通过上调Caspase-3的表达诱导肝癌细胞凋亡起到抗肝癌作用有关。体外实验中清肝化瘀颗粒主要成分苦参碱可通过下调Bcl-2、Beclin1的表达,上调Bax、P53的表达,抑制肝癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,调控细胞自噬。
马路园[2]（2021）在《LINC13及ACTR分别调控氧化应激及糖酵解介导肝癌耐药的机制研究》文中研究说明肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）以下简称“肝癌”,占原发性肝癌85%-90%,到2025年估计全球年发病人数将超过100万例,是目前我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因,严重威胁我国人民的生命和健康。超过60%肝癌患者诊断时已处于疾病中晚期,系统药物治疗是可以选择的最重要的治疗方法。然而药物抵抗是目前中晚期肝癌治疗面临的最突出、最棘手的问题,也是治疗失败最根本的原因。像许多其他癌症一样,肝癌亦具有高度异质性,即便患者具有相似疾病表型,也可能具有不同的分子分型,使得治疗反应不尽相同。在分子水平上对患者进行分层有助于制定个体化治疗方案,提高药物疗效,降低耐药率,改善患者预后。因此,迫切需要阐明肝癌耐药的分子机制,筛选可预测肝癌耐药的分子标记物,并寻找控制耐药的新靶点。奥沙利铂（oxaliplatin,OXA）和索拉非尼分别是目前肝癌系统化疗和靶向治疗最常用的一线药物。OXA属于第三代铂类药物,作为一种双功能烷基化剂,OXA可以共价结合DNA形成铂-DNA复合物,阻断DNA复制和转录,杀伤肿瘤细胞。已有研究报道,铂类药物的化学抗性是导致临床化疗效果欠佳的重要原因,而同一基因的不同改变可能会带来抗药性或增强的药物敏感性。基因水平可反映药物疗效,部分可作为预测药物治疗反应的生物标志物,根据目标基因设计针对肿瘤患者的个性化药物可为临床提供最有效的化疗药物。随着非编码RNA研究的深入,发现部分长链非编码RNA（Long non coding RNA,lnc RNA）在调控基因转录、翻译及功能方面具有重要作用,亦可作为重要分子辅助HCC的诊疗。因此,筛选OXA耐药相关lnc RNA,评估其在肝癌患者OXA化疗耐药中的作用机制具有重要临床意义。索拉非尼是第一个用于晚期肝癌系统治疗的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKI）类药物,也是目前系统治疗的一线靶向药物。目前,索拉非尼耐药已成为限制其临床应用的重要原因,也是晚期HCC治疗中的一个主要挑战。然而,索拉非尼耐药机制尚未明确,亟需探索索拉非尼耐药相关新分子及耐药机制,为临床控制索拉非尼耐药提供新方向。第一部分肝癌OXA耐药相关新分子LINC13及其临床意义目的:通过OXA耐药引起的HepG2细胞差异表达分子确定OXA耐药相关新分子,并探索其临床意义。方法:1.结合目前临床肝癌患者化疗过程中OXA高耐药率的现状,我们首先运用大剂量药物冲击法建立了OXA耐药（OXA resistance,OXA-R）HepG2细胞系,结合克隆形成实验、流式细胞术分析HepG2细胞发生OXA耐药后细胞增殖及凋亡率的变化。提取OXA敏感（OXA sensitive,OXA-S）及OXA-R细胞总RNA,进行转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）,重点分析OXA耐药引起差异的lnc RNAs。结合逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）初步确定与OXA耐药相关性最高的lnc RNA。2.筛选癌症基因组图谱（The cancer genome atlas,TCGA）数据中病理诊断为HCC的患者342例。运用数据库中HCC患者LINC13数据绘制ROC曲线,确定LINC13的cutoff值。将HCC肝癌患者分为LINC13高、低水平2组,统计2组患者临床病理特征（年龄、性别、Child-pugh分期、肿瘤大小、病理分期、临床分期、血管浸润及临床预后）,分析LINC13水平与肝癌患者临床病理特征及预后的关系。3.运用基因表达谱交互分析网站（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）分析364例肝癌患者LINC13水平与总生存期（Overall survival,OS）及无病生存期（Diesase free survival,DFS）的关系,并绘制Kaplan-Meier生存曲线。4.回顾性从中国人民解放军总医院、广州医科大学附属肿瘤医院收集肝癌患者的肿瘤组织样本共153例,包括接受OXA静脉化疗的82例和不含OXA静脉化疗的71例,均具有完善的预后信息。提取153例肝癌组织总RNA,通过RT-PCR检测LINC13水平;分析LINC13水平与患者预后（即无进展生存期Progression-free survival,PFS）的关系,绘制Kaplan-Meier生存曲线。肝癌的诊断需符合2019年《原发性肝癌诊治规范》中肝细胞癌的诊断标准,课题经过中国人民解放军总医院、广州医科大学附属肿瘤医院的伦理委员会批准。本课题的相关实验符合赫尔辛基宣言的要求,并得到河北医科大学第三医院伦理委员会的批准。5.根据OXA治疗效果,将接受OXA化疗的82例患者分为OXA-S组及OXA-R组,每组挑选10例肝癌组织蜡块进行荧光探针原位杂交（Fluorescent In Situ Hybridization,FISH）,检测OXA-S及OXA-R肝癌组织LINC13水平,分析LINC13与OXA耐药的关系。结果:1.筛选肝癌细胞OXA耐药相关新分子我们成功建立了OXA-R的HepG2细胞系（耐药指数为3.36）。在OXA刺激下,与OXA-S细胞相比,OXA-R细胞增殖能力较强（P<0.01）、凋亡率较低（P<0.01）。RNA-Seq结合RT-PCR证实,LINC13是OXA-R细胞上调最为明显的lnc RNA（P<0.01）。2.LINC13与肝癌预后的关系分析TCGA数据库中364例HCC患者数据发现,LINC13水平与肝癌大小、临床分期、血管浸润及预后有关（P<0.05）,并且是肝癌预后的独立危险因素（P=0.003）。运用GEPIA网站分析LINC13与肝癌预后关系发现,与低水平LINC13肝癌患者相比,高水平LINC13肝癌患者临床预后较差,表现在患者OS（P=1.3e-05）和DFS较短（P=0.003）。3.LINC13与不同化疗方案患者预后的关系回顾性收集82例接受OXA治疗的肝癌患者,统计发现高水平LINC13患者43例,低水平LINC13患者39例;71例接受不含OXA化疗方案的患者中,高水平LINC13患者48例,低水平LINC13患者23例。分析各组患者LINC13与PFS关系发现,在接受OXA静脉化疗的HCC患者中,与低水平LINC13的患者相比,高水平LINC13患者PFS较短（P=0.001）;在接受不含OXA静脉化疗的HCC患者中,LINC13水平与PFS无关（P=0.306）。4.OXA敏感及耐药肝癌组织LINC13水平荧光探针原位杂交检测10例OXA-S及10例OXA-R肝癌组织荧光探针法LINC13水平,发现与OXA-S患者相比,OXA-R患者肝癌组织LINC13水平较高（P<0.01）。结论:1.LINC13是肝癌OXA耐药相关的新分子。2.LINC13与肝癌进展有关,是肝癌患者预后的独立危险因素。第二部分LINC13调控SM1介导肝癌OXA耐药的可能机制目的:结合转录组测序数据分析OXA耐药相关基因富集所在的信号通路,进一步阐明LINC13调控的靶基因引起OXA耐药的可能机制。方法:1.根据RNA-Seq数据中差异m RNA分析OXA耐药相关的基因所在的信号通路,富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）探索LINC13水平与OXA耐药相关基因富集的关系;流式细胞术初步探索OXA-S和OXA-R细胞ROS水平。2.统计TCGA数据库中364例肝癌患者LINC13水平,及可能的耐药通路中已经报道与耐药发生有关的基因（SM1、KEAP1、NQO1、BLVRB及GPX2）的水平,分析LINC13与各抗氧化应激基因的相关性,确定与LINC13相关性最高的基因可能为LINC13的靶基因。3.初步确定抗氧化应激基因中与LINC13相关性最高的基因,结合GEPIA网站分析SM1与肝癌患者OS及DFS关系;同时应用RT-PCR检测153例肝癌组织SM1水平,分析SM1水平对接受OXA化疗的82例HCC患者及71例接受不含OXA化疗方案的患者PFS的影响;4.提取OXA-S和OXA-R的HepG2细胞总RNA及总蛋白,检测SM1转录及蛋白水平;免疫组织化学染色法检测10例OXA-S及10例OXA-R肝癌组织SM1的表达水平。5.提取LO2、HepG2、HCC-LM3、Hu H-7、Hep3B、MHCC97H细胞总RNA及总蛋白,分别检测LINC13转录水平及SM1蛋白水平并进行相关性分析;分析SM1与肝癌OXA耐药的关系。6.分子克隆技术构建LINC13及SM1重组质粒,通过细胞转染、RT-PCR、western blot分析LINC13对SM1靶向调控作用。CCK-8法检测HepG2、MHCC97H细胞在不同浓度OXA作用下的存活率,确定IC50。结果:1.OXA耐药相关通路及LINC13与可能耐药通路之间的关系根据RNA-Seq数据分析OXA耐药相关信号通路,发现抗氧化应激通路是OXA耐药相关基因主要富集的通路之一,且GSEA分析发现LINC13与抗氧化应激相关基因富集量正相关（P=0.006）。流式细胞术证实OXA耐药细胞较敏感细胞ROS水平低（P<0.01）。2.分析LINC13与抗氧化应激通路部分基因的相关性分析364例TCGA数据库中肝癌患者的基因表达量的相关性,证实LINC13与抗氧化应激相关通路中SM1、KEAP1、NQO1及GPX2正相关,其中LINC13与SM1相关性最高（P<0.0001,R=0.295）。3.SM1与肝癌患者预后及OXA治疗效果的关系结合GEPIA网站分析364例肝癌患者SM1水平与预后的关系,发现高水平SM1患者OS及DFS较短但无统计学意义;分析临床接受OXA静脉化疗的患者SM1水平与预后关系,发现与低水平SM1患者相比,高水平SM1患者PFS较短（p=0.007）;接受不含OXA静脉化疗的肝癌患者SM1水平对PFS无影响。4.SM1在OXA-S及OXA-R肝癌组织的表达水平与OXA-S的HepG2细胞相比,OXA-R细胞SM1转录及翻译水平较高（P<0.01）;与OXA-S肝癌组织相比,OXA-R肝癌组织SM1表达水平较高（P<0.01）。5.LINC13与SM1的关系及调控机制与肝脏LO2细胞相比,HCC细胞中LINC13转录水平及SM1蛋白水平较高,相关性分析发现LINC13转录水平与SM1蛋白水平呈显着正相关（R=0.972,P=0.0012）。与对照组相比,在HepG2细胞过表达LINC13后SM1水平明显升高,在MHCC97H细胞沉默LINC13后SM1水平明显降低（P<0.01）。CCK-8法测定HepG2细胞应用OXA的IC50为9.14μM,MHCC97H细胞应用OXA的IC50为14.87μM。结论:1.LINC13与抗氧化应激反应正相关,可能通过促进抗氧化应激反应导致OXA耐药。2.LINC13靶向调控SM1,可能通过抗氧化应激途径介导OXA耐药。第三部分肝癌细胞中LINC13调控SM1的分子机制目的:分析LINC13调控SM1及OXA在LINC13-SM1途径中的作用。方法:1.通过FISH技术观察LINC13在HepG2及MHCC97H的细胞定位,初步确定LINC13调控SM1发生在转录后翻译水平还是在转录水平。2.从NCBI网站查找SM1的启动子区域,通过PROMO、Gene Cards及UCSC网站联合预测SM1的转录因子,应用韦恩图取网站预测转录因子的交集。结合双荧光素酶报告基因实验检测转录因子（NRF2、STAT3、ATF3、KLF5、SF1）与LINC13共转染后对SM1启动子的激活作用,最终确定SF1为SM1的转录因子。3.根据JASPAR网站预测SF1与SM1结合的序列,继而构建SM1启动子及其突变体重组质粒。通过细胞转染技术、双荧光素酶报告基因实验确定LINC13及SF1对SM1的转录的影响及结合位置。4.双荧光素酶报告基因实验分析LINC13、OXA对SM1启动子的作用;通过Ch IP实验分析LINC13、OXA对SF1转录结合SM1的作用,阐明LINC13、OXA对SM1转录调控机制。5.将HepG2、MHCC97H两个细胞系分为对照组、转染LINC13组、加SF1抑制剂光辉霉素（Mithramycin A,MMA）组、转染LINC13后加MMA组,通过RT-PCR鉴定LINC13转染效率,通过Western blot分析SM1蛋白水平,分析LINC13调控SM1翻译的机制。6.选10例高LINC13水平及10例低LINC13水平的肝癌组织,并取对应的20例癌旁组织进行免疫组织化学染色和荧光探针原位杂交,检测LINC13、SM1、SP1在肝癌组织中的水平,分析LINC13水平与SM1及SF1在组织表达的相关性。结果:1.LINC13在肝癌细胞中的定位观察LINC13在HepG2及MHCC97H两个细胞系的定位,证实LINC13在细胞核及细胞质均有表达,但主要定位于细胞核。2.筛选SM1转录因子及结合启动子的可能位置PROMO、Gene Cards及UCSC网站联合预测发现SF1为SM1的转录因子。结合双荧光素酶报告基因实验证实,NRF2、STAT3、ATF3、KLF5、SF1转录因子中,在LINC13存在条件下SF1可明显提高SM1启动子活性;LINC13可显着提高SM1的启动子活性,转录因子SF1与SM1的结合位点在SM1启动子区域的第二段。3.LINC13、OXA可调控SM1启动子活性双荧光素酶报告基因实验证实LINC13、OXA可提高SM1的启动子活性;Ch IP实验进一步证实LINC13、OXA通过增强SF1募集到SM1启动子区域发挥转录调控SM1的作用。4.LINC13通过SF1调控SM1蛋白表达LINC13可促进SM1表达,MMA可抑制SM1表达,LINC13不可逆转MMA对SM1的抑制作用,证实LINC13通过SF1调控SM1表达。5.临床样本分析LINC13与SF1、SM1相关性肝癌蜡块组织中LINC13水平、SF1、SM1表达鉴定及相关性分析发现,高水平LICN13较低水平LINC13肝癌组织SF1、SM1表达较高,且肝癌组织LINC13、SF1、SM1的水平均显着高于癌旁组织。结论:1.LINC13在转录水平发挥调控SM1的作用。2.LINC13、OXA可通过增强SF募集到SM1启动子区域发挥转录调控作用。3.LINC13与SF1、SM1表达正相关,并且LINC13通过SF1调控SM1表达。第四部分LINC13-SF1-SM1轴促进抗氧化应激反应导致肝癌OXA耐药目的:探索LINC13-SF1-SM1轴调控HCC细胞活性氧及谷胱甘肽水平,分析氧化还原稳态在OXA耐药中的作用。方法:将HepG2细胞分为对照组,过表达LINC13组,过表达SF1组,SM1敲除（knockout,KO）细胞过表达LINC13组,SM1 KO细胞过表达SF1组;将MHCC97H细胞分为对照组,沉默LINC13组,沉默LINC13再回转SM1组。将HepG2细胞分为对照组,过表达LINC13组,加MMA组,过表达LINC13后加MMA组。运用过表达及敲低转染技术进行如上实验。各组细胞加入不同浓度OXA后通过CCK-8法检测细胞存活率;克隆形成实验检测细胞增殖情况;通过流式细胞术分析细胞活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）水平;谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物（glutathione/glutathione disulfide,GSH/GSSG）试剂盒检测细胞GSH/GSSG比率。结果:1.LINC13-SF1-SM1对OXA作用下肝癌细胞存活率的影响与对照组相比,沉默LINC13、MMA、敲除SM1均可增强OXA杀伤HCC细胞的作用（P<0.01）;过表达LINC13、SF1可减弱OXA对HepG2细胞的杀伤作用。回转SM1可逆转沉默LINC13后OXA对MHCC97H细胞的强杀伤作用;过表达SF1或LINC13不能逆转SM1 KO HepG2后OXA对细胞的杀伤作用;过表达LINC13后不能减弱MMA联合OXA对HepG2细胞杀伤作用。2.LINC13-SF1-SM1对OXA作用下肝癌细胞ROS水平的影响OXA可刺激HCC细胞ROS水平升高;与OXA组相比,过表达LINC13、SF1后可减弱OXA对细胞的刺激作用,ROS水平降低;沉默LINC13、加MMA或SM1 KO可增强OXA对细胞的刺激作用,ROS水平升高;SM1可逆转LINC13沉默的作用;而LINC13、SF1无法逆转SM1KO的作用;且LINC13无法逆转MMA的作用。（P<0.05）3.LINC13-SF1-SM1对OXA作用下肝癌细胞谷胱甘肽水平的影响OXA可降低HCC细胞GSH/GSSG比例;过表达LINC13、SF1后可减弱OXA对细胞的刺激作用,GSH/GSSG较OXA组升高;沉默LINC13、MMA或SM1 KO可增强OXA对细胞的刺激作用,GSH/GSSG较OXA组明显降低;SM1可逆转LINC13沉默的作用;而LINC13、SF1无法逆转SM1 KO的作用;且LINC13无法逆转MMA的作用。（P<0.05）结论:1.LINC13调节SF1-SM1途径,抑制OXA对HCC细胞杀伤作用。2.LINC13-SF1-SM1轴促进HCC细胞抗氧化应激反应导致OXA耐药。第五部分ACTR调控糖酵解作用介导肝癌索拉非尼耐药目的:筛选索拉非尼耐药相关新分子及其调控索拉非尼耐药的机制。方法:1.通过基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）筛选包含索拉非尼治疗敏感及耐药的肝癌RNA-Seq数据集;初步筛选索拉非尼耐药相关基因。在裸鼠接种索拉非尼敏感和耐药细胞,待形成异种移植瘤后提取肿瘤组织总RNA鉴定索拉非尼耐药相关基因水平,初步确定索拉非尼耐药相关新分子。2.结合TCGA数据库中364例HCC临床数据,分析ACTR水平与肝癌患者OS的关系,并在GEPIA网站分析ACTR与糖酵解基因（GLUT1、PKM2及LDHA）的相关性。3.将HepG2细胞分为对照组、加糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose,2-DG）组、敲除ACTR（ACTR KO）组、ACTR KO加2-DG组、ACTR KO细胞回转ACTR组、ACTR KO细胞加2-DG后再回转ACTR组;将Hu H-7细胞分为对照组、加2-DG组、沉默ACTR组、沉默ACTR后加2-DG组、沉默ACTR再回转ACTR组、沉默ACTR加2-DG再回转ACTR组;通过CCK-8法及克隆形成实验检测各组细胞存活及增殖情况;Seahorse XFe96仪检测细胞外酸化率（extracellular acidification rate,ECAR）和氧消耗率（oxygen consumption rate,OCR）水平。4.回顾性研究纳入初始未经任何治疗、具有肝癌组织样本的患者126例。患者来自中国人民解放军总医院,肝细胞癌的诊断需符合2019年《原发性肝癌诊治规范》的诊断标准,课题已经过中国人民解放军总医院及河北医科大学第三医院伦理委员会批准。对126例患者肝癌组织进行免疫组织化学染色,分析ACTR、LDHA及PKM2表达情况,并进行相关性分析。结合oncomine数据库进一步分析ACTR与部分糖酵解基因的相关性。结果:1.筛选索拉非尼耐药相关新分子从GEO数据库筛选出索拉非尼敏感和耐药异种移植瘤差异基因,发现ACTR在索拉非尼耐药异种移植瘤中明显上调,通过裸鼠成瘤实验分析敏感和耐药移植瘤中索拉非尼耐药基因差异表达情况,初步确定ACTR是索拉非尼耐药上调最明显的基因（P<0.01）。2.ACTR与肝癌患者预后及糖酵解基因的关系分析GEPIA网站中TCGA肝癌患者数据,364例患者中高水平ACTR患者182例,低水平ACTR患者182例。与低水平ACTR患者相比,高水平ACTR患者OS较短（P=0.024）。通过GEPIA网站数据进行相关性分析发现,ACTR与糖酵解基因GLUT1（R=0.32）、PKM2（R=0.38）、LDHA（R=0.40）呈显着正相关（P<0.0001）。3.ACTR-糖酵解途径对索拉非尼作用下细胞存活率及增殖的影响与对照组相比,沉默或敲除ACTR后Hu H-7及MHCC97H细胞生长减慢、增殖减弱,对索拉非尼的敏感性增强。2-DG可增强索拉非尼抗肿瘤作用。回转ACTR可逆转沉默或敲除ACTR增敏索拉非尼的作用,但不能逆转2-DG增敏索拉非尼的作用。4.ACTR-糖酵解途径对索拉非尼作用下细胞外酸化率（extracellular acidification rate,ECAR）及耗氧率（oxygen consumption rate,OCR）的影响与对照组相比,沉默ACTR、索拉非尼可抑制肝癌细胞ECAR水平,抑制糖酵解作用;沉默ACTR可增强索拉非尼抑制ECAR水平,增强抑制索拉非尼抑制糖酵解的作用;回转ACTR后可逆转这一作用,恢复糖酵解能力。与对照组相比,沉默ACTR、加索拉非尼可增强细胞有氧呼吸能力,表现在氧化磷酸化功能增强、耗氧率升高;回转ACTR后可逆转沉默ACTR的作用,减弱细胞有氧呼吸,降低氧化磷酸化水平及耗氧量。（P<0.01）5.临床样本分析ACTR与糖酵解基因的相关性对126例临床样本进行免疫组织化学染色证实,肝癌患者ACTR与LDHA、PKM2表达正相关或（P<0.01）;结合Oncomine网站分析基因相关性,证实ACTR与糖酵解相关基因GLUT1/PKM2/LHDA/PFKL/ENO1等均存在正相关（P<0.05）。结论:1.ACTR是索拉非尼耐药中显着上调的新分子,与糖酵解作用有关。2.ACTR通过调节糖酵解作用导致索拉非尼耐药。结论:1.LINC13是肝癌OXA耐药相关的新分子。2.LINC13调控SF1-SM1途径增强抗氧化应激反应导致OXA耐药。3.ACTR是肝癌索拉非尼耐药相关的新分子。4.ACTR通过调节糖酵解作用导致索拉非尼耐药。
何彬[3]（2019）在《HDAC抑制剂JNJ-26481585单药和协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究》文中认为背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的发病率在我国高居恶性肿瘤的第四位,死亡率更是高居第三位。我国每年新发肝癌46.6万,每年因肝癌死亡42.2万,两者均占全世界总数的50%以上。肝细胞癌具有起病隐匿、早期诊断困难、肝切除术后容易复发转移和晚期治愈率低等特点,对我国乃至全球人民的健康造成极其严重的危害。因此,早期肿瘤标志物的寻找、个体化精准诊断和治疗的实施、预后复发转移预警标记物的确立是目前肝癌诊治中亟需解决的问题。目的1.比较HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌与相应癌旁组织中的表达差异,分析HDAC1、HDAC2、HDAC4的表达与肝癌患者临床病理特征及预后之间的相关性,从而验证HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌中作为新型分子标志物的潜在价值。2.明确JNJ-26481585对肝癌细胞体外增殖和体内成瘤的抑制作用,并利用细胞和分子生物学技术探讨JNJ-26481585抑制肝癌细胞增殖的机制,进一步探究JNJ-26481585促进肝癌细胞G0/G1期阻滞及诱导肝癌细胞凋亡的具体机制。3.明确JNJ-26481585与Sorafenib联合应用可以呈协同方式,抑制肝癌细胞体外增殖和体内成瘤,进一步探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用在体内外协同抑制肝癌细胞增殖的分子机制。4.探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠的毒副作用。方法1.使用蛋白免疫印迹、免疫组织化学实验评估HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌组织和对应癌旁组织中的表达水平,评价HDAC1、HDAC2、HDAC4在这两种组织中的表达差异。根据免疫组织化学评分结果,分析111例肝细胞癌组织中IHEDAC1、HDAC2、HDAC4的表达水平与临床病理特征及预后之间的相关性。2.使用实时荧光定量PCR实验评估HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝癌细胞系和正常永生化肝细胞QSG-7701中mRNA的表达水平。3.通过CCK-8细胞活力检测、平板克隆形成、EDU实验,评估JNJ-26481585对肝癌细胞增殖的抑制作用。利用流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡,探究JNJ-26481585对肝癌细胞周期、凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验评估JNJ-26481585对细胞周期相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的作用。4.利用流式细胞术检测AKT抑制剂MK2206 2HCL对JNJ-26481585诱导细胞周期的影响,利用蛋白免疫印迹实验探索JNJ-26481585诱导细胞周期阻滞的分子机制。5.利用流式细胞术检测Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对JNJ-26481585诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探索JNJ-26481585诱导细胞凋亡的分子机制。6.利用流式细胞术检测JNK抑制剂SP600125对JNJ-26481585诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探究JNJ-26481585诱导细胞凋亡的分子机制。7.利用CompuSyn软件计算JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后的联合指数（Combination Index,CI）,明确 JNJ-26481585 与 Sorafenib 联合应用呈协同方式,并且确定两药联合应用的最佳搭配浓度。8.利用流式细胞术检测细胞凋亡,探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对肝癌细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验评估JNJ-26481585对细胞凋亡相关蛋白的作用。9.利用流式细胞术检测JNK抑制剂SP600125对JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后协同促进细胞凋亡的分子机制。10.在裸鼠HCC-LM3皮下移植瘤模型中,评估JNJ-26481585在体内抑制肝癌细胞生长以及与Sorafenib联用后抑制肝癌细胞增殖的作用。11.利用HE染色法检测裸鼠HCC-LM3皮下移植瘤模型体内重要脏器的组织形态学变化,探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠的毒副作用。12.利用免疫组化检测裸鼠瘤体组织的磷酸化JNK、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP、Ki67的蛋白表达情况;通过Tunel染色检测瘤体肿瘤细胞的凋亡情况;从而在体内探索JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后协同促进细胞凋亡的分子机制。结果1.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平在肝癌组织中要高于相应癌旁组织。2.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平与肝细胞癌患者临床病理特征存在密切关系,即HDAC1在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,门静脉血管就越容易被肿瘤侵犯,TNM分期就越高以及更低的组织学分化程度;HDAC2在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,组织学分化程度就越差;HDAC4在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,TNM分期就越高以及更低的组织学分化程度。3.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平与肝细胞癌患者术后总体生存率存在着密切关系,即低表达HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的患者术后总体生存时间要明显长于高表达患者。4.HDAC1、HDAC2、]HEDAC4在肝癌细胞系中的mRNA表达水平要高于正常肝细胞。5.JNJ-26481585通过调控PI3K/AKT通路,下调磷酸化AKT,上调p21,促进周期相关蛋白的表达,从而诱导肝癌细胞周期阻滞。6.JNJ-26481585通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化JNK,促进促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP、Bax 的表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-2、Survivin的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。7.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内外均能够协同抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡。8.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内外通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化 JNK,促进促凋亡蛋白 Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。9.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠体内重要脏器无明显毒副作用。结论1.HDAC1、HDAC2、HDAC4 在肝癌组织显着高表达,HDAC1、HDAC2、HDAC4的表达与肝细胞癌患者临床病理特征存在密切关系,高表达HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的患者术后总体生存时间要明显短于低表达患者。2.HDAC1、HDAC2、HDAC4对患者预后具有预警价值,未来有希望作为肝细胞癌术后新型预警分子标记物。3.JNJ-26481585通过调控PIBK/AKT通路,下调磷酸化AKT,上调p21,促进周期相关蛋白的表达,从而促进肝癌细胞的周期阻滞。4.JNJ-26481585通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化JNK,促进促凋亡蛋白的表达,抑制抗凋亡蛋白的表达水平,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。5.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内体外通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化 JNK,促进促凋亡蛋白 Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。6.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠体内重要脏器无明显毒副作用。
孙宝信,胡大为,薛承岩[4]（2008）在《端粒酶与腹腔肿瘤关系的研究》文中指出
左国华[5]（2008）在《肝癌患者外周血中循环肿瘤细胞的检测及其生物学特性》文中研究表明目的:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是临床上最常见的恶性肿瘤之一,以其高发病率和高度恶性行为着称,占我国癌症死亡率的第二位,肿瘤切除或肝移植是治疗该病的最有效手段,但术后复发转移率高严重影响了治疗的效果。部分肝癌病人在肝癌切除或肝移植前,已有肿瘤细胞脱落进入血循环系统中,入血的循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）是导致肝癌术后复发和转移的首要条件。因此,检测循环肿瘤细胞对判断肝癌的转移复发、指导临床治疗具有重要意义。大多数学者在肝癌患者外周血中检测AFP mRNA,作为判断循环肿瘤细胞的指标,但部分肝炎或肝硬化的患者检测结果提示该方法假阳性率较高,其特异性令人难以满意,且单标志物检测容易出现假阴性。研究显示端粒酶大多数（85-100%）的肿瘤细胞中表达,多数正常体细胞不表达,而端粒酶蛋白催化活性亚单位（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）是合成端粒酶的限速亚基,对端粒酶活性调控起着决定性的作用。hTERT表达在AFP阴性的肝癌中也有很高的发生率,hTERT表达阳性诊断肝癌的敏感性为73.9%,特异性为100%,显示hTERT的基因表达是比端粒酶更敏感的诊断指标。因此我们推测hTERT mRNA做为循环肿瘤细胞检测的标志物,可避免合并肝炎或肝硬化的肝癌患者中假阳性的干扰,应具有良好的癌特异性。免疫磁珠（Immunomagnetic bead,IMB）技术是近年来发展起来的一项新的免疫学技术,免疫磁珠细胞分离是应用最主要的一个方面,具有简便易行、分离纯度高、特异性高、同时保留细胞活性的优点。与常规检测技术（如免疫细胞化学、RT-PCR、流式细胞仪等）相结合,能在106-7个单核细胞中分离检测出一个肿瘤细胞,可弥补这些技术的不足,并改善这些技术对循环肿瘤细胞检测的敏感性及特异性。因此,本研究以肝细胞癌为研究对象,在构建肝细胞癌免疫磁珠的基础上,联合免疫细胞荧光技术进行循环肿瘤细胞形态学分析,以及巢式RT-PCR技术联合检测AFP mRNA和hTERT mRNA,并尝试对富集分离出来的循环肿瘤细胞进行培养,为检测及防治肝癌的血液转移提供理论依据和方法。方法:（1）利用碳二亚胺偶联法,在磁珠上包被单抗HAb18,制备肝癌免疫磁珠后,将微量肝癌HepG2细胞与外周血单个核细胞悬液混匀,再通过免疫磁性细胞分离,行免疫细胞化学鉴定,检测免疫磁珠的特异性和敏感性,并计算癌细胞的回收率。（2）采集肝癌患者56例、肝炎和肝硬化患者19例、继发性肝癌患者11例血样,及18个健康志愿者的血样作为阴性对照。用Ficoll密度梯度离心与免疫磁珠技术首先对患者的外周血进行癌细胞的富集,然后运用FITC-CK标记富集癌细胞,免疫细胞荧光技术对循环肿瘤细胞行形态学分析,并用巢式RT-PCR技术联合检测AFP mRNA和hTERT mRNA。（3）对8例富集分离出来的循环肿瘤细胞进行培养,通过测定生长曲线和细胞倍增时间,锚着独立性试验了解克隆集落能力,扫描电镜观察细胞表面超微结构,以及裸鼠移植及成瘤观察等方法研究其细胞生物学特性。结果:（1）包被HAb18的免疫磁珠能与HepG2细胞敏感而特异地结合,当单个核细胞与HepG2细胞比为1×106:1时可检测到癌细胞,结合免疫细胞化学方法可检出外周血单个核细胞中57.2%的微量癌细胞,无假阳性。（2）在用肝癌HepG2细胞所做的2组预实验中,免疫磁珠联用增强了巢式RT-PCR的灵敏度、特异性,其灵敏度为5ml血中含有一个癌细胞。（3）在临床样品的实验中,免疫磁珠富集后,结合免疫细胞荧光方法观察肝癌患者外周血中循环肿瘤细胞,检出阳性率为42.9%（24/56）,检出细胞的形态可分为四类:中等细胞型、大细胞型、有核细胞碎片和无核细胞碎片。（4）肝癌患者外周血中AFP mRNA及hTERT mRNA的阳性检出率分别为55.4%、48.2%。AFPmRNA及hTERT mRNA的检出率和TNM分期、远处转移临床参数密切相关。当肝癌直径大于5cm、多结节、伴门静脉癌栓,AFPmRNA及hTERT mRNA的检出率均明显提高（P<0.05）。血清AFP水平、肝癌分化程度等与AFPmRNA及hTERT mRNA的检出率无显着相关（P>0.05）。67.9%的肝癌患者至少表达一种标志物,35.7%的患者两种标志物均阳性。AFP mRNA和hTERT mRNA的检出呈正相关,相关系数为0.256。hTERT mRNA在AFP mRNA阳性和阴性的肝癌患者检出率分别为64.5%、28%（P<0.05）。AFP mRNA在肝炎和肝硬化患者中检出率为21.1%（ HCC vs肝炎和肝硬化,P<0.05）,继发性肝癌患者及健康成人均未检出;hTERT mRNA在继发性肝癌患者中检出率为63.6%,而肝炎和肝硬化及健康成人中均未检出。（5） 8例标本中,其中7例培养未成功,仅有1例出现肿瘤细胞增生,异型性明显,命名为HCC-27,共传代培养5代。免疫细胞化学染色证实为肝癌细胞,HCC-27细胞的增殖及独立锚着生长能力显着低于HepG2细胞（P<0.05）。两只裸鼠经脾内接种培养肿瘤的细胞,其中一只裸鼠出现肝内移植瘤生长。结论:（1）成功利用碳二亚胺耦联法制备了一种抗人肝细胞癌免疫磁性微珠,制备的肝癌免疫磁珠能从外周血单个核细胞中分离检测微量肝癌细胞,有较好特异性和敏感性。（2）通过免疫磁珠细胞分选技术富集,结合免疫细胞荧光方法可对肝癌患者外周血中的循环肿瘤细胞进行形态学检测。循环肿瘤细胞形态分为四类:中等细胞型、大细胞型、有核细胞碎片和无核细胞碎片。（3）肝癌患者外周血单核细胞经免疫磁珠富集后,联合检测肝细胞特异性AFP mRNA和癌特异性hTERT mRNA,有助于提高患者外周血循环肿瘤细胞检测的敏感性和特异性。（4）肝癌外周血中的循环肿瘤细胞经免疫磁珠细胞富集分离后培养,1例培养成活,这是肝癌血行播散的直接证据。培养成活的细胞具有肝细胞癌的组织学特征,其生长增殖及锚着独立生长能力低,但具有转移潜能。
李松岗[6]（2003）在《端粒酶逆转录酶及其相关基因表达与肝细胞癌细胞凋亡、增殖关系的实验研究》文中研究说明肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，已上升为第二位肿瘤死亡的原因，恶性程度高，发展迅速，转移较快，无瘤生存期短。虽然经过半个世纪的努力，在肝癌外科治疗上取得很多的成绩，但是传统外科手术加化疗或放疗等方法都有其局限性，根治性切除术后复发率仍居高不下。因此，加强肝癌分子病理机制的研究，探讨肝癌生物治疗的新途径，可能是进一步提高肝癌治疗效果的有效途径。 端粒酶逆转录酶是1997首次在人与鼠基因组中发现的四膜虫P128同源类似物，为一单拷贝基因，定位于5P15.33，是端粒酶活性构成的核心成份之一，将其导入端粒酶阴性表达的细胞株，可有效激活端粒酶，使细胞恢复增殖，是端粒酶激活的限速因素。故对hTERT表达的研究有助于了解端粒酶的作用机制。目前hTERT在肝癌发生、发展中的作用还不明确，有学者认为其是肝癌早期诊断极为可靠的指标，尤其是AFP检测阴性肿瘤组织和较难诊断的小肝癌；但采用原位杂交方法对非肿瘤组织的检测发现hTERT在非肿瘤组织肝细胞中存在着明显阳性表达；出现研究结果差异的原因还不清楚。hTERT与肝细胞癌临床病理特征关系还不确定；有学者认为hTERT表达强度与组织去分化程度之间的负相关决定了端粒酶活性表达与肿瘤分化程度的关系，但其他研究结果并不支持这种观点；与肿瘤大小的关系还存在相反的看法；还未发现与其他临床病理特征之间的关系。这些不确定因素的存在使hTERT在肝癌诊断与治疗领域的运用价值不明确。 浙江大学博士学位论文 C－myc的转录水平反映着组织细胞的增殖状态，研究发现c－myc只有与同样具有bHLH－ZIP结构的 Max构成异二聚体，才可发挥转录活性。hTERT启动区内含有的多个 c－myc结合位点提示c－myc可能是hTERT表达调控因子，这种调控关系已在其他肿瘤的研究中得到证实，然而体外研究发现用药物处理肝癌细胞后，可导致端粒酶与hTERT表达水平明显下降，但c－myC表达没有任何变化，这提示在不同细胞种群中C－ITlyC影响hTERT方式可能存在差异。目前尚无肝细胞癌组织中hTERT与c－myc表达关系的研究报道。 细胞凋亡与增殖之间的动态平衡是机体维持细胞总数稳定、清除异常细胞与维持正常机体功能状态所必须，二者之间平衡失调可直接导致肿瘤发生、发展，端粒酶再次激活与肿瘤凋亡、增殖平衡失调密切相关，体外实验证明：抑制细胞端粒酶活性，可导致端粒长度持续缩短，细胞生长抑制，凋亡增加；端粒酶广泛表达于大多数肿瘤组织中，端粒酶的表达与反映细胞增殖状态的增殖相关抗原＊－67表达具有高度一致性，是反映肿瘤细胞增殖状态的一个很好指标。hTERT是端粒酶激活的关键因素，二者在肿瘤组织中的表达具有高度的一致性：因此，可以推测盯＊RT表达与细胞增殖、凋亡的关系；h＊＊RT与细胞增殖之间的相关性在其他一些肿瘤组织中己得到证实，在肝癌中仅见一篇相关报道，且没有对hTERT表达与hi67增殖指数间关系进行比较分析；还不清楚肝癌hTERT表达与肿瘤组织hi67增殖指数之间的关系：体外抑制h＊＊RT表达的实验说明，抑制h＊＊RT表达可导致一些细胞增殖停 滞，凋亡增加；但在肝细胞癌细胞株的研究并没有发现hTERT表达与细胞凋亡之间的直接 联系。 有基于此，本课题采用RT－PCR、TUNEL与免疫组化的方法，检测了肝细胞癌hTERT、 c－myc表达情况与细胞增殖、凋亡指数，并对其中可能存在的关系进行比较分析，以期为今 后hTERT在临床诊断与治疗的运用提供理论与实验依据。 第一部分：肝细胞癌端粒酶逆转录酶表达以及与临床病理特征的关系 目 的：研究端粒酶逆转录酶（hTERT ）在肝细胞癌以及相应癌旁组织中的表达情 况，并与肿瘤临床病理特征进行比较分析，以探讨hTERT表达在肝癌发生， 发展进程中作用以及可能的临床诊断价值。 2 浙江大学博士学位论文 材料方法：32例肝细胞癌组织以及相应癌旁组织标本取自2000年10月～2001年6月 浙江大学医学院第二附属医院。采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测 hTERT在肝细胞癌组织和相应癌旁组织的表达情况，样本按hTERT表达阳 性和阴性表达分组与年龄、HBSAg、肝硬化、肿瘤大小、包膜、肿瘤癌灶。 癌栓、肿瘤病理分级和临床分期等临床病理指标进行比较分析。 结 果：l、32例肝癌组织样本中，hTERT表达阳性的有27例，占总数84．38．％； 阴性表达有5例，占15．62％，癌旁组织中仅有三例表达阳性（9．38％）， 而且表达强度明显低于相应肿瘤组织；二者比较有统计意义（P＜0刀5）。 二、肝细胞癌组织hTERT表达与年龄、HBSAg、肝硬化、包膜、肿瘤癌灶、 癌栓、肿瘤病理分级和临床分期等临床病理指标之间无
项琼[7]（2020）在《益气除瘤方对介入术后肝细胞癌的干预及诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究》文中研究表明目的:研究益气除瘤方治疗介入术后肝细胞癌患者的临床疗效及预后分析,通过动物实验进一步探寻益气除瘤方抑制肝癌进展的分子机制,为益气除瘤方的临床应用提供依据。方法:第一部分文献研究:对肝癌中医病因病机及治疗现状进行综述总结,并对益气除瘤方的源流与现代研究进行论述。第二部分临床研究:回顾性分析益气除瘤方在介入术后肝细胞癌患者治疗中的临床疗效及与终点事件的相关性。1.收集2018年1月至2019年6月武汉大学人民医院、武汉大学人民医院东院等2个院区中医科和介入科住院诊断及门诊诊断为肝细胞癌病例,筛选符合纳入标准和排除标准病例。记录患者基线数据,包括:性别、年龄、有无合并肝炎、肝癌分期、Child-pugh分级、介入手术治疗方式、有无合并其他疾病及使用益气除瘤方的时间等。调取病历记录介入治疗前后三个月中医症状及生存质量情况,收集肿瘤标志物、血清酶学指标及肝脏影像学等结果,以生存时间作为观察结局,查阅死亡病历方式或电话追踪其总生存时间。以是否使用益气除瘤方三个月或三个月以上为分组条件,分为观察组（益气除瘤方为主方联合对症治疗）和对照组（仅接受对症治疗）。2.比较两组患者基线资料、介入治疗3个月前后的肿瘤进展情况、中医症状积分、生存质量评分（KPS）、肿瘤标志物水平（AFP、PIVKA）、血清酶学水平（ALT、AST、γ-GGT、ALP、CK、LDH）等,记录无进展生存时间（PFS）和总生存时间（OS）。3.采用Epidata3.1软件进行数据双重录入并进行一致性检验。使用SPSS23.0软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用x±s表示,非正态分布计量资料采用M（Q25-Q75）,计数资料采用百分率表示。计量资料组间比较采用独立或配对样本t检验或Mann-Whitney U检验,计数资料比较采用?2检验进行分析。计算各组人群中不同结局的发生率,采用Kaplan-Meier法计算两组患者终点事件的累计发生率,并通过Log-rank检验比较各组的差异。采用Cox比例风险模型进一步探究两组患者不同结局事件风险比（HR）,并使用Cox比例风险模型分析各相关因素与肝癌相关不良事件发生之间的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。第三部分实验研究:益气除瘤方抑制H22荷瘤小鼠肝癌进展的可能分子机制。1.60只SPF级雌雄各半BALB/C小鼠,随机分为空白组、模型组、益气除瘤方低剂量组（简称YQCLL组）、益气除瘤方中剂量组（简称YQCLM组）、益气除瘤方高剂量组（简称YQCLH组）、槐耳颗粒组（简称HE组）,每组10只。除空白组外,其余小鼠构建H22肝癌小鼠模型。空白组、模型组小鼠每日予以生理盐水灌胃,YQCLL组予以益气除瘤方低剂量（5g/kg/d）灌胃,YQCLM组予以益气除瘤方中剂量（10g/kg/d）灌胃,YQCLH组予以益气除瘤方高剂量（20g/kg/d）灌胃,HE组小鼠予以槐耳颗粒（1.6g/kg/d）灌胃,测量并记录各组小鼠体重、腹径、进食量的变化。连续10d。2.10d后,处死小鼠,采集眼眶静脉取血。检测各组小鼠血液分析（WBC、Hb、PLT）、肝肾功能（ALT、AST、BUN、Cr）;ELISA法检测各组小鼠血清白介素6（IL-6）水平。取脾脏、胸腺、肝脏,计算各组小鼠胸腺指数、脾脏指数、肝脏指数。3.取各荷瘤组小鼠腹水,采用Hochest染色法观察各组小鼠腹水H22细胞凋亡情况,流式细胞仪检测H22细胞凋亡率。4.采用Westernblot法检测各组小鼠H22细胞JAK2/STAT3通路相关蛋白（JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3）的表达;检测凋亡相关因子（BAX、BCL-2、Caspase-3）的表达,计算相对光密度值。5.所有数据用SPSS23.0软件分析,以均数±标准差（x±s）表示。多个组间资料数据比较,先行方差齐性检验,若方差齐则采用方差分析（one-way,ANOVA）,方差不齐则采用秩和检验。组内两两比较选用t检验或多重比较t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。结果:第二部分临床研究结果:1.入组可评价病例112例,其中观察组58例,对照组54例。治疗后3个月,两组患者的各指标均有所好转,与治疗前比较,差异有统计学意义（P<0.05）。治疗后3个月,观察组较对照组肝癌实体瘤病灶稳定率更高,能明显改善胁痛、腹胀、纳呆食少、肢体倦怠乏力等症状,KPS评分提高显着,中医症状单项积分与总积分下降显着（P<0.05）;观察组的AFP、PIVKA及降低更显着,与对照组比较,差异有统计学意义;在血清酶学的比较上,观察组患者ALT、AST、LDH水平治疗后明显降低,与对照组比较,差异有统计学意义。2.在生存时间比较上,两组PFS结果相似,观察组（4.72±0.204）月VS对照组（4.47±0.193）月,差异无统计学意义;观察组OS延较对照组延长,观察组（13.97±0.638）月VS对照组（12.17±0.561）月,差异有统计学意义。3.Cox回归分析结果:单因素回归分析显示,患者生存时间与是否使用益气除瘤方、性别、肿瘤大小、肿瘤数目、Child-pugh分级、有无肝炎及肝癌分期有关,差异有统计学意义;而生存时间与患者的年龄、合并疾病及介入方式的选择无关;多因素回归分析中体现出相同的趋势,益气除瘤方的使用、肝癌分期、肿瘤大小、肿瘤数目均是影响HCC患者总生存期的关键性因素。亚组分析结果显示,以年龄分层,在55～64岁年龄组,对于早期肝癌、肿瘤大于5cm、多发肿瘤的患者,益气除瘤方可显着降低患者死亡风险;在18～54年龄组,其生存获益与有无肝炎、分期有关;在65岁以上年龄组,其生存获益与性别、肝癌分期、肿瘤大小有关。第三部分实验研究结果:1.各组小鼠在体重、腹径及进食量的结果比较上,各荷瘤组与空白组比较,差异有统计学意义。YQCLH组、HE组小鼠的体重和进食量有所增加,腹径有所减少,与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH组与HE组在三者的比较,差异无统计学意义。2.在胸腺指数、脾脏指数及肝脏指数的结果比较上,各荷瘤组与空白组比较,差异有统计学意义。YQCLH组、HE组的胸腺指数和脾脏指数较高,肝脏指数较低,与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH组与HE组比较,差异无统计学意义。3.在血液分析的结果比较上,各荷瘤组小鼠WBC及Hb数值下降,与空白组比较,差异有统计学意义;各荷瘤组小鼠组间比较,差异无统计学意义。各荷瘤组与空白组的PLT数值比较,差异无统计学意义。YQCLH组和HE组WBC数值略高,与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH组与HE组比较,差异无统计学意义。在肝肾功能的比较上,各荷瘤组与空白组比较,差异有统计学意义。YQCLH组和HE组ALT、AST、BUN、Cr较模型组低,与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH组与HE组比较,差异无统计学意义。4.在血清IL-6水平的比较上,各荷瘤组与空白组比较,差异有统计学意义。YQCLH组和HE组IL-6水平较模型组低,与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH组与HE组比较,差异无统计学意义。5.益气除瘤方对H22细胞凋亡的作用:⑴Hochest染色结果表明,模型组、YQCLL组、YQCLM组、YQCLH组、HE组蓝色荧光细胞数目均不一致。模型组中,可见少量的蓝色荧光细胞;YQCLH组、YQCLM组、YQCLL组、HE组均可见较多蓝色荧光细胞,其中,YQCLH组、HE组可见大量蓝色荧光细胞,同时出现典型的凋亡小体,染色质浓缩,核碎裂成大小不等的圆形小体。H22细胞在益气除瘤方剂量增大时逐渐出现凋亡,且药物浓度越大,凋亡特征越明显,具有正常形态的细胞越少见,结果优于HE组。⑵流式细胞仪检测H22凋亡率结果表明,YQCL各组和HE组的H22细胞凋亡率均较模型组明显增加;YQCLL组、YQCLM组、YQCLH组三组依药物浓度递增而出现凋亡率逐渐增加,与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH组的细胞凋亡率最高,和HE组比较,差异有统计学意义。6.益气除瘤方对JAK2/STAT3信号通路的干预作用:Westernblot结果显示,JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白在益气除瘤方各组与HE组的表达量均有所减少;其中,YQCLH组、YQCLM组和HE组蛋白表达下降明显,与模型组比较,差异有统计学意义。YQCLH组在JAK2、p-STAT3蛋白的表达水平下降,与HE组比较,差异有统计学意义。7.益气除瘤方对细胞凋亡通路的干预作用:Westernblot结果显示,BAX、Caspase-3在模型组中的表达量减少,而在YQCLL组、YQCLM组、YQCLH组与HE组的表达量明显增加,YQCLM组、YQCLH组、HE组与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH与HE组比较,差异无统计学意义。BCL-2在模型组中的表达量增加,在YQCLL组、YQCLM组、YQCLH组与HE组的表达量均有不同程度下降,YQCLH组、HE组与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH与HE组比较,差异有统计学意义。结论:益气除瘤方能明显改善介入术后HCC患者临床症状,提高患者生存质量,延缓肝癌进展,降低死亡风险,延长总生存期。益气除瘤方可能通过抑制血清IL-6水平,抑制JKA2/STAT3信号通路转导活化,调控线粒体细胞凋亡因子BAX、BCL-2、Caspase-3的表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡。
杨宏毅[8]（2020）在《TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制》文中进行了进一步梳理研究背景卵巢癌作为妇科生殖系统三大恶性肿瘤之一,临床起病隐匿,缺乏有效早期诊断指标,容易复发和转移,化疗极易产生耐药性,而放疗大多不敏感,预后差。因此,深入研究卵巢癌发生发展的分子机理,对于寻找有效早期诊断指标、预后判断指标和基因靶向治疗具有重大指导意义。端锚聚合酶（tankyrase,TNKS）属于聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP）蛋白家族,可与端粒酶重复绑定序列结合。人类TNKS1基因在第8号染色体p23.1上,作为调控端粒长度的关键因子在多种疾病中发挥重要作用,与多种恶性肿瘤的发生发展关系密切,与卵巢癌的关系尚不清楚。Wnt/β-catenin信号传导通路在恶性肿瘤的发生和发展中起重要作用,同时研究证实TNKS对Wnt信号通路进行正调控。本文率先系统地研究了 TNKS1通过调控Wnt/β-catenin信号传导通路来影响卵巢癌发生发展的相关机制。研究目的本研究从临床样本、细胞水平、动物模型以及分子机制层面,系统立体研究TNKS1在卵巢癌发生发展中的作用及机制,为卵巢癌诊疗提供理论依据。研究材料和方法1.采用q-PCR、免疫组化和Western blot技术研究TNKS1在卵巢癌组织中的表达。2.采用MTS法、细胞集落形成、裸鼠皮下移植瘤实验研究TNKS1对卵巢癌细胞增殖与成瘤的影响。3.采用MTS法和凋亡实验研究TNKS1表达改变对卵巢癌细胞药物敏感性的影响。4.采用细胞划痕实验和Transwell转移小室实验研究TNKS1在卵巢癌迁移与侵袭中的作用。5.采用葡萄糖摄取、乳酸分泌、ATP生成以及线粒体氧耗率研究TNKS1在卵巢癌细胞有氧糖酵解中的作用。6.采用Western blot技术及细胞转染法研究TNKS1参与卵巢癌发生发展的分子调控机制。7.应用SPSS 21.0进行统计分析,实验结果以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.TNKS1在卵巢癌组织中的表达高于癌旁组织及正常卵巢组织,且与卵巢癌患者的病理分级和肿瘤大小密切相关。2.敲低或抑制TNKS1显着抑制卵巢癌细胞增殖、细胞集落形成、体内成瘤及细胞周期进展,并有效提高卵巢癌细胞对常用化疗药物敏感性,显着抑制其迁移和侵袭能力;同时通过降低丙酮酸羧化酶表达降低卵巢癌细胞的糖代谢,提高线粒体耗氧率。3.敲低或抑制TNKS1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,进而下调Snail、PC、CyclinD、MDR、MMP-9 等 Wnt/β-catenin 信号通路靶蛋白的表达。TNKS1、Snail和PC在临床卵巢癌组织中表达两两之间呈正相关。结论TNKS1在卵巢癌组织中高表达,具有一定的临床意义。TNKS1可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路活性进而促进卵巢癌生长与成瘤、迁移与侵袭和降低药物敏感性;并通过β-catenin/Snail/PC信号轴促进卵巢癌细胞的有氧糖酵解。TNKS1在卵巢癌发生发展中发挥重要作用,可作为卵巢癌潜在的早期诊断指标、判断预后指标或靶向基因治疗靶点。
范冰冰[9]（2020）在《赤芍总苷抗肝肿瘤药效物质分析及作用机制研究》文中研究表明目的赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veichii Lynch的干燥根。味苦,性微寒,归肝经,有清热凉血、散瘀止痛的功效。用于热入营血,温毒发斑,吐血衄血,目赤肿痛,肝郁胁痛,经闭痛经,症瘕腹痛,跌扑损伤,痈肿疮疡等症。赤芍总苷具有多种药理作用,如抗血栓、抗氧化、抗肿瘤、抗内毒素、保护神经系统和心脏等作用。本课题对赤芍的有效组分赤芍总苷进行提取、纯化及药效筛选研究,采用UPLC-QTOF-MS等现代分析仪器和方法对赤芍总苷的化学成分进行研究;采用网络药理学研究方法,利用疾病靶点数据库、Swiss Target Prediction、SEA等网络数据库平台的大数据资源,揭示赤芍总苷治疗肝癌所调控的靶点及信号通路。通过H22荷瘤肝癌小鼠模型及体外Hep G2细胞模型,开展赤芍总苷抗肿瘤体内及体外药理、药效学研究,明确赤芍总苷是否具有抗肝肿瘤作用;并从细胞周期、凋亡、相关基因、蛋白角度及对细胞色素P450酶不同亚型活性及基因水平的影响对赤芍总苷发挥抗肝肿瘤作用的机理进行研究;通过大鼠血清中肝损伤、氧化应激、线粒体损伤指标的含量变化,探究赤芍总苷是否引起大鼠肝脏毒性。本研究明确赤芍总苷具有抗肝肿瘤作用,并从多角度阐释其作用机制,为赤芍总苷的临床应用及进一步开发利用提供实验依据和理论基础。方法1.采用紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法,通过L9（34）正交试验设计,以液料比、提取时间、提取次数为考察因素,以芍药苷、赤芍总苷、出膏率的综合评分为评价指标,筛选赤芍总苷最佳提取工艺;采用紫外-可见分光光度法,结合大孔树脂技术,通过静、动态吸附与解吸试验,筛选赤芍总苷的最佳纯化工艺。采用MTT法,通过肝癌Hep G2细胞增殖抑制率比较赤芍、赤芍总苷体外抗肝肿瘤作用。2.采用UHPLC-Q-TOF-MS技术,结合对照品、文献、相关数据库信息比对的办法,对赤芍总苷化学成分进行研究;采用分子网络研究方法,构建赤芍总苷分子离子可视化网络图,结合质谱相关信息,全面表征赤芍总苷成分。3.采用体外药效MTT法,以细胞增殖抑制率为评价指标,开展赤芍总苷对肝癌Hep G2细胞增殖影响的研究;通过建立H22肝癌荷瘤小鼠模型,以抑瘤率、脏器指数、瘤体病理切片及血清中细胞因子ALT、AST、FAS、FASL、IL-2、IFN-γ、TNF-α的含量为考察指标,开展赤芍总苷体内抗肝肿瘤药效学研究。4.采用网络药理学研究方法,利用TCMSP、SEA及Swiss Target Prediction网络数据库平台的大数据资源,挖掘赤芍总苷成分调控靶点基因信息;利用Drugbank、Dis Ge NET、及TTD数据库,查找肝癌相关靶点,从而得到赤芍总苷成分调控肝癌的生物学靶点;采用STRING等数据库,得到靶点之间蛋白互作网络图,探讨靶点之间的相互关系,并通过对靶点进行GO基因功能注释分析,明确赤芍总苷成分参与调控肝癌生物过程、细胞组成和分子功能;进而利用KEGG数据库对靶点进行信号通路富集分析,从大数据方面揭示赤芍总苷治疗肝癌所调控的靶点及信号通路。5.利用流式细胞仪,采用Annexin V-FITC/PI双染色法,开展赤芍总苷对肝癌Hep G2细胞凋亡影响的研究;采用PI单染色法,开展赤芍总苷对肝癌Hep G2细胞周期影响的研究。6.采用实时荧光定量q RT-PCR技术,检测经赤芍总苷作用于肝癌Hep G2细胞后,细胞中相关基因的表达量;采用Western Blot技术,检测经赤芍总苷作用于肝癌Hep G2细胞后,细胞中相关蛋白的表达量,分别从基因及蛋白水平阐释赤芍总苷抗肝肿瘤作用机制。7.通过ELISA法检测大鼠肝脏中细胞色素P450亚酶CYP1A2,CYP3A4,CYP2D6,CYP2C9,CYP2E1活性,采用实时荧光定量q RT-PCR技术检测CYP1A2,CYP3A2,CYP2D1,CYP2C11,CYP2E1 m RNA水平的表达,考察赤芍总苷对细胞色素P450酶不同亚型的影响。8.通过ELISA法检测大鼠血清中ALT、AST、ALP及γ-GT的含量变化,探究赤芍总苷对肝脏组织的损伤程度;通过ELISA法检测大鼠血清中SOD、MDA及GSH的含量变化,探究赤芍总苷对肝脏组织氧化损伤的程度;通过ELISA法检测大鼠血清中Na+-K+-ATPase的含量变化,探究赤芍总苷对肝脏组织线粒体的损伤程度。结果1.赤芍总苷的最佳提取工艺为8倍量30%乙醇,回流提取2次,每次2 h;赤芍总苷的最佳纯化工艺为选用HPD-700大孔吸附树脂,上样生药浓度为0.1g/m L,树脂比上柱量为0.3g/m L（原药材/湿树脂）,2BV水除杂,5BV 30%乙醇洗脱,即得赤芍总苷化学物质组分。赤芍、赤芍总苷作用于肝癌Hep G2细胞的增殖抑制率分别为69.66%、66.00%。2.采用UHPLC-Q-TOF-MS技术,经正离子检测模式,经对照品、文献与相关数据库信息确定芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷;比对推测出芍药内酯苷异构体、毛蕊异黄酮苷、牡丹皮苷E、没食子酰芍药苷或异构体构建赤芍总苷的分子可视化网络,共找到5个分子网络成分簇,其中一个分子簇为芍药苷及其相关化合物。3.利用TCM-SP、SEA及Swiss Target Prediction网络数据库平台,挖掘出赤芍总苷成分共调控139个潜在靶蛋白。利用Drugbank、Dis Ge NET、及TTD数据库,共找到5727个癌症相关靶点。通过VENNY软件对赤芍总苷各成分靶蛋白与肝癌潜在靶点进行映射,共得到99个交集靶点,主要包含IL-2、Bcl-2、TNF、PTEN等。通过靶点之间蛋白互作网络图,明确靶点之间的相互关系,并通过对靶点进行GO基因功能注释分析,明确赤芍总苷成分在生物过程方面主要富集于细胞增殖的正调控、凋亡过程的负调控、MAPK级联、炎症反应的负性调节等;在细胞组成方面主要富集于线粒体、细胞外间隙、死亡诱导信号复合物等;在分子功能方面主要富集于一氧化氮合酶调节活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性、生长因子活性等各种蛋白酶活性。KEGG通路富集分析结果显示有84条通路参与到赤芍总苷作用于肝癌细胞的过程,主要包括MAPK、PI3K/Akt、VEGF、肿瘤坏死因子、癌症中心碳代谢等信号通路。4.体外药效实验结果显示,赤芍总苷1mg/m L给药浓度作用于肝癌Hep G2细胞24h,36h,48h的抑制率分别为66.00%、72.52%、74.10%,IC50值分别为0.71、0.57、0.52mg/m L;体内药效实验结果显示,环磷酰胺组、赤芍总苷低、中、高剂量组的抑瘤率分别为57.61%、23.06%、36.64%、48.13%,除赤芍总苷低剂量组,肿瘤的抑制作用均超过30%（中药的瘤重抑制率>30%,评定药物具有抑瘤作用）,符合相关要求。5.与模型组比较,赤芍总苷高、中剂量组血清中ALT、AST、FAS、FASL的含量显着降低、IL-2的含量显着升高,均有显着性差异（p<0.01或p<0.05）,赤芍总苷各剂量组血清中IFN-γ、TNF-α的含量显着降低,均有显着性差异（p<0.01）。6.赤芍总苷作用于肝癌Hep G2细胞36h,低、中、高剂量组的凋亡率分别为11.7%、16.9%、22.9%;与模型组比较,赤芍总苷中剂量组肝癌Hep G2细胞G2/M期的比例降低。7.赤芍总苷作用于肝癌Hep G2细胞36h后,与模型组比较,赤芍总苷组细胞中Akt、Bcl-2、PI3K、MEK、ERK m RNA和蛋白的水平均不同程度降低,均有显着性差异（p<0.01）,PTEN、Bax m RNA的水平均不同程度升高,均有显着性差异（p<0.01）。8.与空白组比较,赤芍总苷组CYP1A2活性显着增强,有显着性差异（p<0.01）,CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9和CYP2E1活性没有显着性变化;与空白组比较,赤芍总苷组CYP1A2 m RNA水平显着升高,有显着性差异（p<0.01）,CYP3A2,CYP2D1,CYP2C11和CYP2E1 m RNA水平没有显着性变化。9.与空白组比较,赤芍总苷组大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、SOD、MDA、GSH及Na+-K+-ATPase的含量没有显着变化。结论1.本课题优化了赤芍总苷的提取纯化方法,其工艺简单且操作方便,为赤芍总苷的后续药效研究奠定了一定基础。2.采用UHPLC-Q-TOF-MS技术、构建赤芍总苷化学成分网络,能够全面表征赤芍总苷成分,并能呈现成分之间的关系,为其开发利用及药效研究奠定实验基础。3.采用网络药理学研究手段,挖掘赤芍总苷成分调控肝癌的生物学靶点,通过蛋白网络互作分析、基因功能注释分析、靶点调控通路分析等,实现赤芍总苷抗肝肿瘤作用机制的快速、系统分析,发现赤芍总苷抗肝癌作用可能与PI3K/Akt、MAPK等信号通路相关。4.赤芍总苷对Hep G2肝癌细胞增殖有抑制作用,其作用机制是通过诱导Hep G2细胞凋亡、降低G2/M期细胞的比例,扰乱细胞正常分裂状态达到抑制作用。5.赤芍总苷能够减轻肝脏损伤程度,对肝脏具有一定的保护作用。6.赤芍总苷发挥抗肝肿瘤作用可能与抑制Hep G2细胞的增殖、诱导其凋亡,调控PI3K/Akt及MEK/ERK信号通路有关。7.赤芍总苷可能通过诱导CYP450酶亚型CYPl A2的活性发挥抗肝肿瘤作用。8.赤芍总苷在一定剂量范围内及一定给药时间内,不影响肝脏的功能,没有肝毒性,值得进一步深入研究。
柯瑞盛[10]（2019）在《miR-423-5p、HNRNPA1在肝细胞癌中的临床意义及分子机制研究》文中研究说明第一章 miR-423-5p在肝细胞癌中的临床意义及分子功能机制研究背景:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）主要是以手术切除为主的综合治疗,但大多数患者预后未达到理想预期。因此,改善HCC的早期诊断和预测预后、探索更多有效的治疗方法,是目前临床上急需解决的难题。MicroRNAs（miRNA）在各种恶性肿瘤的进展中起关键作用。表达异常的miRNA具有显着的临床意义,能够调控肿瘤进展的相关过程,表现出改善肿瘤靶向治疗的巨大潜能。本研究从GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中的HCC相关miRNAs差异表达谱,筛选到了在HCC中表达水平显着上调的miR-423,进一步预测了其潜在靶基因为转化生长因子β受体III（Transforming growth factor beta receptor III,TGFBR3）,并结合已有文献报道,本研究推测miR-423可能是通过调控TGFBR3来影响PI3K/AKT通路发挥其在肝癌中的功能。本项目的研究结果将丰富肝癌中功能miRNA的种类,为该疾病的提供一种新的生物标记物及潜在治疗靶点。目的:本研究通过临床研究、功能研究及分子机制研究,评估miR-423-5p和TGFBR3在肝细胞癌中的临床意义,以及肝细胞癌进展中的生物学功能和分子机制。方法:先从GEO数据库四个不同的数据集中筛选得到了在HCC中表达异常的miR-423,并用生物信息学预测其靶基因为TGFBR3,Kaplan Meier-plotter数据库分别分析miR-423和TGFBR3与肝癌患者的预后关系,FunRich软件分析miR-423-5p和TGFBR3可能涉及了PI3K/AKT信号通路。再用生物信息学分别分析了miR-423-5p和TGFBR3在GEO和TCGA数据库的HCC相关数据中的表达水平和临床意义,使用LinkedOmics数据库分别对miR-423-5p和TGFBR3在HCC中行表达关系分析和GSEA分析,用在线STRING数据库构建TGFBR3的蛋白-蛋白互作（PPI）网络,并分析TGFBR3基因在人体肿瘤中可能涉及的KEGG信号通路。再回顾性收集本中心132例肝癌患者的组织标本和临床预后信息,使用定量实时PCR（qRT-PCR）用于评估miR-423-5p和TGFBR3的表达。通过ROC曲线分析,Kaplan-Meier生存曲线分析和多因素Cox回归分析等统计方法分别评估miR-423-5p和TGFBR3的临床意义。体外细胞实验研究miR-423-5p和TGFBR3对HCC细胞中细胞生物行为的影响:MTT实验法检测HCC细胞增殖能力,Transwell法观察HCC细胞迁移及侵袭能力,流式细胞术测HCC细胞凋亡情况;体内实验通过构建裸鼠成瘤模型检测miR-423-5p和TGFBR3不同表达对肿瘤生长的影响。双荧光素酶报告基因实验和蛋白质免疫印迹实验（Western Blot,WB）验证HCC中miR-423-5p和TGFBR3之间的表达调控关系。WB实验评估分子机制研究中PI3K/AKT通路涉及的关键蛋白质水平,并用分别用MTT法,Transwell小室法,流式细胞术等检测在HCC细胞中miR-423-5p和TGFBR3是否通过PI3K/AKT通路影响细胞生物学行为。结果:通过对4个GEO数据集中分析筛选,我们寻找HCC中关键基因miR-423,miR-423在GEO数据库（GSE22058）/TCGA数据库总均为高表达。Kaplan Meier-plotter数据库分别结果表明miR-423高表达的HCC患者预后不良（P<0.05）,在GSE20594数据集中miR-423高表达与HCC患者BCLC分期,血管侵犯显着相关（P<0.05）。LinkedOmics数据库结果提示TCGA中miR-423表达与HCC患者的年龄、种群、病理分级、肿瘤T分期、肿瘤N分期、总体生存预后均显着相关（n=375例,P<0.05）。GSEA分析结果显示miR-423可能参与HCC发生发展的细胞周期,DNA复制,癌症相关miRNA,p53信号通路等肿瘤发展相关生物学活动。miR-423-5p在HCC组织和细胞系中的表达均显着上调。在132例HCC患者中,miR-423-5p可以用作诊断生物标志物来区分HCC组织和非癌组织。高表达的miR-423-5p与患者的淋巴结转移,TMN分期及生存预后较差等均显着相关。HCC细胞中表达上调的miR-423-5p在体外可促进HCC细胞增值,迁移侵袭和抑制细胞凋亡,并于体内可促进肝癌生长。GEPIA,Kaplan Meier-plotter和CCLE数据库结果显示TGFBR3在人类不同肿瘤中主要呈现低表达,与多种肿瘤的不良预后相关。TGFBR3蛋白的PPI网络分析也富集得到TGFBR3蛋白参与多种癌症发生和进展相关的KEGG通路。生物信息学分析提示HCC中TGFBR3可能是miR-423-5p靶基因,在LinkedOmics数据库中低表达的TGFBR3与miR-423-5p表达呈负相关。TGFBR3在HCC组织和细胞系中的表达显着降低。我们通过双荧光素酶报告实验和蛋白质免疫印迹实验证明了miR-423-5p在HCC中靶向负调控TGFBR3,miR-423-5p过表达可抑制TGFBR3的表达。低表达的TGFBR3与132例HCC患者的TMN分期,淋巴结转移和生存预后较差均具有显着相关。肝癌细胞中TGFBR3过表达在体外具有抑制HCC细胞增值,迁移侵袭和促进凋亡作用,并且在体内可以抑制肿瘤生长。miR-423-5p上调表达可激活PI3K/AKT信号通路影响HCC细胞的生物学活动。表达上调的TGFBR3能够拮抗逆转miR-423-5p过表达的生物学功能及其对PI3K/AKT信号通路的激活作用。结论:miR-423-5p和TGFBR3的表达异常均可作为HCC患者两种候选诊断和预后的生物标志物。在HCC中,高表达的miR-423-5p可能通过靶向负调控抑制TGFBR3表达,从而激活了PI3K/AKT信号通路活性来促进HCC增殖,转移侵袭等恶性进展。抑制miR-423-5p表达或增强TGFBR3表达的治疗策略可能有助于改善HCC预后并且可作为肝癌潜在的治疗靶标。第二章 HNRNPA1在HBV相关肝细胞癌中的临床价值及分子机制研究背景:由于乙型肝炎病毒（HVB）感染率较高,使得中国每年新发HCC患者占到全世界新发病例总数的55%。然而,根治性切除和肝移植等综合多种治疗的预后仍未达到满意预期。根据报道,约有30%HCC患者的AFP为阴性,发现其他敏感肿瘤生化标志并研究其分子机制,对于HCC患者尤为重要。大量研究表明,HNRNPA1在人类多种恶性癌症中表达异常且参与肿瘤的进展及预后。HNRNPA1在HBV阳性HCC中的功能作用研究相对较少,本研究结合生物信息学分析希望可以了解HNRNPA1与HBV阳性HCC（HBV-HCC）患者临床预后之间的关系,并探讨HNRNPA1在HBV-HCC中的分子机制,为HCC的早期及时干预和个性化治疗提供新防治思路和的治疗靶点。目的:探讨HNRNPA1表达在HBV阳性肝细胞癌（HCC）中的临床价值,并初步对HNRNPA1在HCC细胞中表达及潜在分子功能进行研究。方法:本研究先利用GEPIA、TCGA、GEO等数据库对HNRNPA1基因在肝细胞癌和正常肝组织中表达进行生物信息学分析,并预测了HNRNPA1表达与肝细胞癌预后的关系。再用逆转录-定量聚合酶链反应法（RT-q PCR）和免疫组织化学法（IHC）验证HCC中HNRNPA1表达,进一步验证HNRNPA1表达与HCC患者预后的关系。再从Linked Omics和c Bio Portal数据库筛选与HNRNPA1共表达基因,DAVID 6.7数据库对HNRNPA1共表达基因进行GO和KEGG分析,用STRING数据库来构建HNRNPA1共表达蛋白-蛋白间的互作网络（PPI网络）,并用Cytoscape软件对PPI网络进行可视化处理。最后在HBV相关的HCC细胞中,用双荧光素酶报告实验和蛋白质免疫印迹实验分析HNRNPA1分别与mi R-22和EGFR信号通路的关系。结果:通过综合分析了来自GEPIA,GEO和TCGA等数据库的数据,结果发现HNRNPA1表达在HBV阳性HCC样品中显着性增高,该结果通过本中心的RT-q PCR和IHC实验验证得到支持。在GSE14520数据集和151例HBV-HCC患者中的生存分析显示HNRNPA1高表达患者的总体存活率显着降低。在GSE14520数据集中高表达的HNRNPA1对HBV相关HCC患者具有一定的预后诊断应用意义。此外,GO和KEGG分析均证明HNRNPA1共表达基因参与翻译,核糖核蛋白复合物生物合成和组装,核糖体生物发生,RNA加工,RNA剪接等。可视化后的PPI网络显示了HNRNPA1与SNRPD1、SNRPD2、POLR2H和RBMX等共表达并存在直接作用。基因组富集分析（GSEA）显示了HNRNPA1可能通过细胞周期和WNT信号传导途径等影响HCC进展。生物信息学预测到了mi R-22基因可能是HNRNPA1上游调控mi RNA,Linked Omics数据库提示了mi R-22低表达与HNRNPA1高表达在HCC中表达关系为负相关,荧光素酶报告实验结果也提示HNRNPA1基因在HBV-HCC中是mi R-22的下游直接靶基因,在mi R-22过表达的HBV-HCC细胞中HNRNPA1表达降低。蛋白质免疫印迹实验结果表明HNRNPA1可能在HBV相关的HCC中通过EGFR信号通路起到癌基因的作用。结论:HCC组织中的HNRNPA1高表达作为癌基因起作用,与HCC术后复发率较高相关。HNRNPA1的表达上调与HBV相关HCC切除术患者的不良预后相关,可以作为HBV相关HCC患者预后的生物学标志物。SNRPD1,SNRPD2,POLR2H和RBMX等蛋白与HNRNPA1蛋白可能存在直接相互作用,并且表达均与HNRNPA1呈现正相关,可能影响HNRNPA1的功能。在HBV相关的HCC中,HNRNPA1是mi R-22的直接负调节靶标,并且HNRNPA1可以通过EGFR信号传导途径充当癌基因,可以作为HBV阳性HCC患者的潜在治疗靶点。
二、肝细胞癌端粒酶活性检测及其临床应用价值（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝细胞癌端粒酶活性检测及其临床应用价值（论文提纲范文）
（1）清肝化瘀颗粒对原发性肝癌大鼠的治疗作用及主要成分对肝癌细胞增殖凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述 肝癌的分子发病机制及中医药抑制肝癌的作用机制研究进展 |
| 1 肝癌的流行病学现状 |
| 2 肝癌的分子发病机制 |
| 3 中医药抗肝癌的作用机制 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠的治疗作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠肝癌细胞凋亡的影响 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 清肝化瘀颗粒主要成分对肝癌细胞增殖凋亡的影响 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）LINC13及ACTR分别调控氧化应激及糖酵解介导肝癌耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 肝癌OXA耐药相关新分子LINC13 及其临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LINC13 调控SM1 介导肝癌OXA耐药的可能机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 肝癌细胞中LINC13 调控SM1 的分子机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 LINC13-SF1-SM1轴促进抗氧化应激反应导致OXA耐药 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 ACTR调控糖酵解作用介导肝癌索拉非尼耐药 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 长链非编码RNA在肝细胞癌耐药中的作用机制及研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）HDAC抑制剂JNJ-26481585单药和协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 HDACs在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白在肝细胞癌组织中表达水平明显升高 |
| 2.2 HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白在肝细胞癌组织中表达水平与肝细胞癌患者临床病理特征的相关性 |
| 2.3 HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白在肝细胞癌组织中表达差异与肝细胞癌患者术后长期生存的相关性 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HDAC抑制剂JNJ-26481585抗肝癌的作用机制研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝癌细胞系和正常永生化肝细胞(QSG-7701)中的表达水平分析 |
| 2.2 JNJ-26481585能够抑制肝癌细胞增殖 |
| 2.3 JNJ-26481585能够抑制肝癌细HDAC1、HDAC2、HDAC4的表达 |
| 2.4 JNJ-26481585能够阻滞肝细胞癌细胞周期进程 |
| 2.5 JNJ-26481585能够促进肝癌细胞凋亡 |
| 2.6 JNJ-26481585通过调控PI3K/AKT和JNK/c-jun通路来影响细胞周期和凋亡 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 HDAC抑制剂JNJ-26481585协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 JNJ-26481585与Sorafenib联用能够协同抑制肝癌细胞增殖 |
| 2.2 JNJ-26481585与Sorafenib联用通过调控JNK促进肝癌细胞凋亡 |
| 2.3 JNJ-26481585与Sorafenib联用对裸鼠成瘤能力的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（4）端粒酶与腹腔肿瘤关系的研究（论文提纲范文）
| 1 端粒酶的生物学作用 |
| 2 端粒酶与腹腔肿瘤 |
| 2.1 端粒酶与胃癌: |
| 2.2 端粒酶与肝癌: |
| 2.3 端粒酶与胆囊癌: |
| 2.4 端粒酶与胰腺癌: |
| 2.5 端粒酶与大肠癌: |
| 2.6 端粒酶与恶性腹水及腹腔转移癌: |
| 3 端粒酶与肿瘤的辅助治疗 |
（5）肝癌患者外周血中循环肿瘤细胞的检测及其生物学特性（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 肝癌患者外周血中循环肿瘤细胞的检测及其生物学特性 |
| 前言 |
| 第一部分 肝细胞癌免疫磁珠的制备及鉴定 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第一部分图片 |
| 第二部分 肝癌外周血中循环肿瘤细胞的检测及临床意义 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分图片 |
| 第三部分 循环肝癌细胞的体外培养及其细胞生物学特性初探 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分图片 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 文献综述肝癌患者循环肿瘤细胞的检测及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 英文论着 |
（6）端粒酶逆转录酶及其相关基因表达与肝细胞癌细胞凋亡、增殖关系的实验研究（论文提纲范文）
| 论文摘要 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 正文 |
| 第一部分 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）益气除瘤方对介入术后肝细胞癌的干预及诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 中医学对肝癌的认识 |
| 1.1.1 肝癌中医病名历史渊源 |
| 1.1.2 肝癌在中医学中的病位研究 |
| 1.1.3 肝癌的中医病因病机 |
| 1.1.4 肝癌中医治则治法探究 |
| 1.1.5 肝癌的中医证治要点 |
| 1.1.6 中医对肝癌预后的认识 |
| 1.1.7 现代中医治疗肝癌的现状 |
| 1.2 肝癌的发生机制与中药实验研究进展 |
| 1.2.1 肝癌发生机制的研究进展 |
| 1.2.2 治疗肝癌的中药复方及单体研究进展 |
| 1.3 益气除瘤方的源流与现代拆方研究进展 |
| 1.3.1 益气除瘤方治疗肝癌的理论依据及源流 |
| 1.3.2 益气除瘤方方解 |
| 1.3.3 益气除瘤方拆方治疗肝癌的实验研究进展 |
| 第二章 益气除瘤方干预介入术后HCC患者的回顾性临床研究 |
| 2.1 方法 |
| 2.1.1 临床资料收集方法 |
| 2.1.2 诊断标准 |
| 2.1.3 纳入标准 |
| 2.1.4 排除标准 |
| 2.1.5 研究方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 纳入病例基本特征 |
| 2.2.2 疗效评价结果 |
| 2.2.3 生存状态结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 AFP、PIVKA和血清酶学水平在HCC辅助诊断中的意义 |
| 2.3.2 HCC的中医临床疗效评价 |
| 2.3.3 多因素回归模型在本研究的意义 |
| 2.3.4 本研究的不足 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 益气除瘤方对H_(22)荷瘤小鼠抗肿瘤机制的实验研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验细胞 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 实验主要试剂 |
| 3.1.5 实验药品 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 实验中给药剂量换算 |
| 3.2.2 给药方法 |
| 3.2.3 BALB/C小鼠H_(22)荷瘤模型建立 |
| 3.2.4 小鼠的一般情况、体重、腹径及平均进食量的检测 |
| 3.2.5 标本处理及保存 |
| 3.2.6 检测各组小鼠血常规及肝肾功能 |
| 3.2.7 检测各组小鼠血清IL-6 水平 |
| 3.2.8 Hoechst法检测各组荷瘤小鼠腹水中H_(22)肝癌细胞凋亡情况 |
| 3.2.9 流式细胞仪检测各组荷瘤小鼠腹水中H_(22)肝癌细胞凋亡率 |
| 3.2.10 Westblot法检测各组荷瘤小鼠H_(22)细胞JAK2/STAT3 信号通路相关蛋白及细胞凋亡因子BAX,BCL-2,Caspase-3 的表达 |
| 3.2.11 统计方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 各组小鼠的一般情况,监测体重、腹径、平均进食量的变化 |
| 3.3.2 各组小鼠的脏器指数比较 |
| 3.3.3 各组小鼠WBC、Hb、PLT指标的比较 |
| 3.3.4 各组小鼠AST、ALT、Cr、BUN结果的比较 |
| 3.3.5 各组小鼠血清IL-6 水平的比较 |
| 3.3.6 各组小鼠腹水中H_(22)细胞Hochest染色的比较 |
| 3.3.7 各组小鼠H_(22)细胞凋亡情况的比较 |
| 3.3.8 各组小鼠H_(22)细胞JAK2/STAT3 信号通路相关蛋白表达水平的比较 |
| 3.3.9 各组小鼠H_(22)细胞凋亡蛋白表达水平的比较 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 动物造模 |
| 3.4.2 对照组药物选用 |
| 3.4.3 动物造模后表现 |
| 3.4.4 益气除瘤方(YQCL)对H_(22)荷瘤小鼠的抗肿瘤作用 |
| 3.4.5 IL-6 诱导JAK2/STAT3 信号通路激活及YQCL的干预作用 |
| 3.4.6 YQCL促 H_(22)细胞线粒体细胞凋亡的作用 |
| 3.5 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文及参编着作情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（8）TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1. 卵巢癌临床研究概况 |
| 1.1 卵巢癌发病流行病学研究进展 |
| 1.2 卵巢癌诊断研究进展 |
| 1.3 卵巢癌治疗研究进展 |
| 2. TNKS研究背景 |
| 2.1 TNKS生物学特性 |
| 2.2 TNKS生物学功能 |
| 2.3 TNKS1介导Wnt通路与恶性肿瘤关系的研究进展 |
| 3. 研究内容和科学意义 |
| 3.1 研究内容 |
| 3.2 科学意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 临床标本 |
| 1.2 细胞系 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 试剂与配置 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 TNKS1敲低细胞模型建立 |
| 2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.4 实时荧光定量 |
| 2.5 免疫印迹(Western blot)检测 |
| 2.6 细胞生长实验(MTS) |
| 2.7 细胞集落形成实验 |
| 2.8 细胞迁移与侵袭实验 |
| 2.9 流式细胞学 |
| 2.10 葡萄糖摄取实验 |
| 2.11 乳酸分泌实验 |
| 2.12 细胞ATP检测 |
| 2.13 双荧光素酶报告基因分析 |
| 2.14 裸鼠皮下移植瘤实验 |
| 2.15 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 1. TNKS1在卵巢癌组织的表达及其临床意义 |
| 1.1 网络数据库TNKS在卵巢癌中的表达 |
| 1.2 临床资料 |
| 1.3 TNKS1在卵巢癌组织中的表达 |
| 1.4 TNKS1在卵巢癌组织中高表达的临床意义 |
| 2. TNKS1促进卵巢癌细胞的体内外增殖 |
| 2.1 TNKS1敲低细胞模型建立 |
| 2.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞体外生长的影响 |
| 2.3 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞周期的影响 |
| 2.4 敲低TNKS1对卵巢癌细胞体内成瘤的影响 |
| 3. TNKS1与卵巢癌耐药性的关系 |
| 3.1 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞药物敏感性的影响 |
| 3.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞凋亡的影响 |
| 4. TNKS1促进卵巢癌细胞的迁移与侵袭 |
| 4.1 细胞划痕修复法检测TNKS1对卵巢癌细胞迁移的影响 |
| 4.2 转移小室法检测TNKS1对卵巢癌细胞迁移与侵袭的影响 |
| 5. TNKS1促进卵巢癌细胞的有氧糖酵解 |
| 5.1 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞葡萄糖摄取的影响 |
| 5.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞乳酸分泌的影响 |
| 5.3 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞ATP生成的影响 |
| 5.4 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞耗氧率的影响 |
| 6. TNKS1通过调控PC表达介导卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 6.1 抑制或敲低TNKS1对卵巢癌细胞丙酮酸羧化酶表达的影响 |
| 6.2 TNKS1通过PC介导卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 7. TNKS1通过激活Wnt/β-catenin/snail信号通路调控卵巢癌发生发展 |
| 7.1 敲低或抑制TNKS1显着抑制Wnt/β-catenin信号通路 |
| 7.2 TNKS1对Wnt/β-catenin信号通路多个靶基因的调控 |
| 7.3 TNKS1通过调控Snail表达而影响PC的表达 |
| 8. TNKS1与Snail、PC蛋白在临床组织表达的相关性分析 |
| 第四章 讨论 |
| 1. TNKSI在卵巢癌中高表达及其临床意义 |
| 2. TNKS1促进卵巢癌细胞快速增殖 |
| 3. TNKS1介导卵巢癌细胞耐药性产生 |
| 4. TNKS1促进卵巢癌细胞转移 |
| 5. TNKS1促进卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 6. TNKS1调控卵巢癌发生发展的分子机制 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 主要缩略语表 |
| 博士期间科研成果 |
| 致谢 |
（9）赤芍总苷抗肝肿瘤药效物质分析及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 赤芍本草考证及赤芍研究进展 |
| 第一节 赤芍本草考证 |
| 第二节 赤芍化学成分和药理作用的研究进展 |
| 第三节 赤芍总苷抗肝癌疗效研究 |
| 第二章 赤芍总苷的提取纯化及化学成分表征研究 |
| 第一节 赤芍总苷提取工艺研究 |
| 第二节 赤芍总苷纯化工艺研究 |
| 第三节 赤芍、赤芍总苷抗肝肿瘤作用比较研究 |
| 第四节 基于液质联用技术赤芍总苷化学成分表征研究 |
| 第五节 基于分子网络的赤芍总苷化学成分可视化分析 |
| 第六节 小结 |
| 第三章 赤芍总苷体内、外抗肝肿瘤药效学研究 |
| 第一节 赤芍总苷体外抗肝肿瘤作用研究 |
| 第二节 赤芍总苷体内抗肝肿瘤作用研究 |
| 第三节 赤芍总苷对H22荷瘤小鼠血清细胞因子的影响 |
| 第四节 小结 |
| 第四章 赤芍总苷作用机制初步研究 |
| 第一节 基于网络药理学的赤芍总苷抗肝癌分子机制研究 |
| 第二节 赤芍总苷对人肝癌细胞周期及细胞凋亡的影响 |
| 第三节 赤芍总苷介导PI3K/Akt信号通路抗肝肿瘤作用研究 |
| 第四节 赤芍总苷介导MEK/ERK信号通路抗肝肿瘤作用研究 |
| 第五节 小结 |
| 第五章 赤芍总苷对大鼠细胞色素P450酶的影响及肝毒性评价 |
| 第一节 细胞色素P450酶的研究概况 |
| 第二节 赤芍总苷对大鼠P450酶亚型的活性影响 |
| 第三节 赤芍总苷对大鼠P450酶亚型mRNA表达的影响 |
| 第四节 赤芍总苷对大鼠血清细胞因子的影响 |
| 第五节 小结 |
| 分析讨论 |
| 结论 |
| 创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 |
| 赤芍总苷药理作用的研究进展 |
| 中药抗肿瘤作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）miR-423-5p、HNRNPA1在肝细胞癌中的临床意义及分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 miR-423-5p在肝细胞癌中的临床意义及分子功能机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料及方法 |
| 第一节 miR-423-5p在肝细胞癌中的临床价值及功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 miR-423-5p靶基因筛选及TGFBR3表达在肝癌中的临床价值及功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 miR-423-5p在肝癌进展中分子作用机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第一章 全章结论 |
| 第一章 文献综述 MicroRNA-423在人类癌症中的调节机制和功能作用 |
| 第二章 HNRNPA1在HBV阳性肝细胞癌中的临床价值及分子机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料及方法 |
| 第一节 HNRNPA1在HVB阳性肝癌肝切除患者中的预后价值研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节HNRNPA1在HBV阳性肝细胞癌中的初步分子机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 全章结论 |
| 第二章 文献综述 HNRNPA1蛋白在消化系统肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、肝细胞癌端粒酶活性检测及其临床应用价值（论文参考文献）
- [1]清肝化瘀颗粒对原发性肝癌大鼠的治疗作用及主要成分对肝癌细胞增殖凋亡的影响[D]. 朱晓燃. 北京中医药大学, 2021
- [2]LINC13及ACTR分别调控氧化应激及糖酵解介导肝癌耐药的机制研究[D]. 马路园. 河北医科大学, 2021(02)
- [3]HDAC抑制剂JNJ-26481585单药和协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究[D]. 何彬. 浙江大学, 2019(03)
- [4]端粒酶与腹腔肿瘤关系的研究[J]. 孙宝信,胡大为,薛承岩. 河北医学, 2008(12)
- [5]肝癌患者外周血中循环肿瘤细胞的检测及其生物学特性[D]. 左国华. 第三军医大学, 2008(03)
- [6]端粒酶逆转录酶及其相关基因表达与肝细胞癌细胞凋亡、增殖关系的实验研究[D]. 李松岗. 浙江大学, 2003(03)
- [7]益气除瘤方对介入术后肝细胞癌的干预及诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究[D]. 项琼. 广州中医药大学, 2020(09)
- [8]TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制[D]. 杨宏毅. 南方医科大学, 2020(01)
- [9]赤芍总苷抗肝肿瘤药效物质分析及作用机制研究[D]. 范冰冰. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [10]miR-423-5p、HNRNPA1在肝细胞癌中的临床意义及分子机制研究[D]. 柯瑞盛. 福建医科大学, 2019(07)