一、流感嗜血杆菌实验室诊断存在的问题与展望（论文文献综述）
国家呼吸医学中心[1]（2021）在《儿童常见呼吸道病原免疫预防专家共识》文中指出随着社会的发展及经济条件的改善, 我国儿童常见呼吸道病原免疫预防水平取得了长足的进步, 儿童呼吸道感染发病率及死亡率在过去十几年中大幅下降, 但与国际领先水平国家相比, 尚存在一定差距, 这与公众对疫苗接种认知不足、接种人员预防接种服务水平参差不齐等诸多因素有关。本共识在综合分析国内外儿童常见呼吸道病原免疫预防临床证据的基础上, 结合我国临床现状及专家临床经验, 就儿童常见呼吸道病原传播特点、临床表现、免疫预防等提出了建议, 为进一步指导儿童常见呼吸道病原免疫预防工作提供参考。
张昆丽,李春玲[2]（2020）在《副猪嗜血杆菌病研究进展》文中研究说明副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）感染引起的猪多发性纤维素性浆膜炎、肺炎、关节炎、脑膜炎等全身性炎症。HPS属于非运动、多形态、有荚膜的革兰氏阴性小杆菌,是猪上呼吸道的条件致病菌。该菌血清型众多,各菌株间毒力差距较大,毒力菌株能感染任何日龄的猪,引起副猪嗜血杆菌病。近年来该病在我国广泛流行,且与多种病毒与细菌混合感染严重,导致猪群发病率和死亡率上升,给我国造成巨大的经济损失,严重影响我国生猪产业的健康发展。介绍了HPS的病原学特性、流行病学、致病机制与毒力因子,综述了副猪嗜血杆菌病的实验室诊断方法、灭活疫苗、亚单位疫苗和菌影疫苗的研究进展,以期为该病的防控提供参考。
龙朋伟[3]（2020）在《2016-2018年北京市流感共感染病原谱研究》文中认为背景:流感病毒与其他病原体共感染是导致社区获得性肺炎高发生率、高致死率的重要原因。社区获得性肺炎早期用药缺乏针对性导致了病程延长、治疗成本升高、细菌耐药率上升。了解与流感病毒相关的社区获得性肺炎的共感染病原体分布特点,可以指导临床合理用药,以及有针对性地预防、控制疫情的发生和流行,减轻社会负担。目的:通过对北京市2016-2018年流感病毒感染的社区获得性肺炎样本进行多种病原体检测,进一步分析北京市流感病毒共感染的病原谱及其规律,为北京市社区获得性肺炎的社区预防和临床诊疗提供理论依据。方法:收集北京市2016-2018年流感病毒核酸检测呈阳性的307例社区获得性肺炎患者的鼻咽拭子、痰液、支气管肺泡灌洗液、胸腔穿刺液等呼吸道样本,提取核酸并进行23种呼吸道病原体的实时荧光定量PCR实验室检测。对检测结果按不同因素分组,使用SPSS 21.0软件,采用?2检验对计数结果进行统计学分析。结果:在所有307例样本中,检测到23种呼吸道病原体中的15种。其中甲型流感病毒阳性的有272例,占全部样本的88.60%;其次为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌阳性92例,占全部样本的29.97%;乙型流感病毒阳性65例,占全部样本的21.17%。流感病毒与其他病原体共感染的比例（68.08%）明显高于流感病毒单独感染的比例（31.92%）。在共感染样本中,最多检测到6种病原体的共感染,流感病毒与细菌共感染占比较高（75.60%）。老年人更易发生共感染,且更易进展为重症。在老年人群和危重症人群中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的阳性率明显偏高。流感病毒共感染的发生率、病原体数目和病原体阳性率的分布在不同性别间没有明显差异。在2016-2018年间,北京市流感病毒感染的社区获得性肺炎大多数发生在春季和冬季（60%）,较少发生在夏季和秋季（40%）。结论:在北京市2016-2018年期间流感病毒阳性的社区获得性肺炎患者中,甲型流感病毒感染率明显高于乙型流感病毒感染率,且共感染的比例显着高于流感病毒单独感染的比例。与呼吸道其他病毒相比,流感病毒与细菌共感染现象更为普遍,主要为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,其次为肺炎链球菌和肺炎克雷伯菌。本研究为预防和指导流感社区获得性肺炎患者的临床治疗策略制订与用药筛选提供了数据支持。
沈文慧[4]（2020）在《副猪嗜血杆菌脂多糖刺激猪肺泡巨噬细胞引起NLRP3的变化及其对NF-κB信号通路的影响》文中认为副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是一种革兰氏阴性菌,在猪的上呼吸道中广泛存在,属于条件致病菌,是引起猪格拉瑟氏病的病原,患病猪以纤维素性浆膜炎、脑膜炎和多发性关节炎为主要特征,主要影响5-8周龄的保育猪,给养猪业造成严重的经济损失。猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar mcrophage cell,PAM）在肺的天然免疫中起到重要作用,是抵御外来病原微生物侵袭肺脏的第一道防线。PAM可以吞噬、杀灭病原,释放细胞因子和趋化因子等免疫因子到感染部位发挥免疫功能,来调控肺部的炎症反应。本研究通过热酚水法提取副猪嗜血杆菌的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）,分别采用硫酸-苯酚法、紫外分光光度法测定LPS提取物中多糖及核酸含量,再通过SDSPAGE电泳银染方法进一步鉴定提取物。将提取的LPS作用于猪肺泡巨噬细胞,探讨N LRP3抑制剂对副猪嗜血杆菌LPS刺激猪肺泡巨噬细胞中IL-1β表达量的影响,研究LP S激活TLR4受体进而诱导NF-κB信号通路的变化规律。研究结果如下:1.副猪嗜血杆菌脂多糖的提取、纯化和鉴定采用热酚水法提取副猪嗜血杆菌血清5型LZ株的LPS,并采用酶解法和超离法纯化副猪嗜血杆菌的LPS提取物,从2.46g HPS菌体沉淀中提取纯化得到LPS 60mg,平均产率为2.44%。用硫酸-苯酚法测定结果显示,所制备的LPS提取物中不含有还原性单糖,多糖浓度为176μg/mL;微量紫外分光光度计测定结果显示,所制备的LPS提取物中核酸含量为430.1μg/mL;银染鉴定结果显示,提取、纯化的副猪嗜血杆菌LPS提取物条带分布在35 kDa160 kDa之间。2.NLRP3抑制剂对副猪嗜血杆菌LPS刺激PAM细胞IL-1β表达量的影响经副猪嗜血杆菌LZ株LPS处理后的细胞,NLRP3炎性复合体明显被激活,而经过MCC950抑制剂处理的细胞NLRP3炎性复合体的活化明显被抑制,同时也抑制了IL-1β的表达。3.LPS激活TLR4进而诱导NF-κB信号通路的变化规律脂多糖（LPS）刺激后,与对照组PAM相比较,加入TLR4 siRNA的PAM细胞质中IκB和P65浓度升高,而p-IκB和p-p65浓度降低,细胞核中p-p65浓度降低。结果表明,通过TLR4被激活后,副猪嗜血杆菌LPS刺激PAM激活TLR4诱导NF-κB通路,将IκB和部分NF-κB磷酸化,部分游离的NF-κB迅速移位到细胞核中,细胞受到刺激后IκB激酶复合体活化,诱导相关基因表达。综上,副猪嗜血杆菌脂多糖刺激、诱导猪肺泡巨噬细胞中IL-1β的分泌和NLRP3炎性复合体的活化,并能激活TLR4蛋白从而引起IκB激酶复合体活化,导致IκB和NFp65磷酸化。该研究揭示了脂多糖在猪副嗜血杆菌感染中的作用,为副猪嗜血杆菌的防治提供了研究数据,具有重要意义。
张恬恬[5]（2020）在《基于微滴式数字PCR技术的百日咳鲍特菌检测方法的建立、评价与应用》文中进行了进一步梳理研究背景百日咳是全世界婴儿发病和死亡的重要原因,它是由百日咳鲍特菌引起的、主要通过飞沫传播的一种急性呼吸道传染病,传染性极强,可感染任何年龄的人,但婴幼儿更敏感。1974年世界卫生组织开始实施扩大免疫规划,此后百日咳发病数和儿童死亡人数急剧减少,但近年来,某些疫苗覆盖率较高的发达国家如英国、美国、澳大利亚、荷兰等相继报道百日咳发病率在保持多年低水平以后再次升高,调查分析认为,一个重要原因就是无症状的百日咳传播,携带百日咳鲍特菌的无症状感染者传播给易感个体,引起其发病或死亡,但百日咳鲍特菌携带者在人群中的携带率和流行病学特征尚不清楚,这主要是由于感染者的临床症状严重程度与细菌载量成正相关,无症状携带者的细菌载量较低而不表现临床症状,在临床中不易被发现。另外目前的实验室检测方法无法满足低载量检测和定量细菌载量这两个要求。作为第三代PCR技术的微滴式数字PCR技术,能够不依靠标准曲线及外参标准品,通过直接计数或利用泊松定律获得目的基因的拷贝数,实现真正的绝对定量,其重复性、准确性和灵敏度具有无可替代的优势,尤其适合低载量病原体的定量。因此,本研究主要目的就是建立基于微滴式数字PCR技术的、适合于检测健康人群中百日咳鲍特菌的绝对定量方法。研究目的1系统地建立一种基于微滴式数字PCR技术的百日咳鲍特菌检测方法,并评价其特异性、灵敏性、重复性和准确性。2比较本研究建立的微滴式数字PCR方法与传统的细菌培养法、荧光定量PCR方法对百日咳鲍特菌的定量研究结果。3探讨微滴式数字PCR方法在健康人群和临床中检测百日咳鲍特菌的应用。研究方法1菌株和质粒百日咳鲍特菌参考菌株（ATCC9797）由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供;含百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis,Bp）的单拷贝基因IS481质粒参考品由北京擎科生物科技有限公司合成。2样本健康人群样本为2018年12月在云南省昭通市采集的无发热、咳嗽等症状村民的鼻咽拭子;临床样本为2018年8月-2019年3月在河北省儿童医院采集的疑似百日咳病例的口咽拭子。3实验方法3.1细菌培养方法2018年12月在中国疾病预防控制中心的云南省昭通市细菌性疾病监测点,选择无发热、咳嗽等症状的健康村民作为研究对象,研究对象入选标准如下:1近一月内无发热、咳嗽、咽痛等呼吸道症状2近一月内未用过抗生素及抗病毒药物3无其他急性、慢性呼吸道疾病采用分层随机抽样方法,分为7个年龄组（<1岁、1-2岁、3-5岁、6-17岁、18-24岁、25-54岁和≥55岁）,每组采样对象30人。由同一受过专业培训的工作人员采集研究对象的两支鼻咽拭子。其中随机采集一侧鼻孔的一支鼻咽拭子在现场接种,将鼻咽拭子先在培养基一区（1/3大小）旋转涂抹,然后用三区划线法将接种环接种于选择性木炭琼脂培养基上（含10%羊血）。接种后的培养基,保温运送至实验室,置于纯氧培养箱,进行传统的分离培养法并应用革兰染色方法、qPCR方法和血清凝集实验进行鉴定。3.2 荧光定量PCR方法3.2.1 样本处理1 健康人群样本:上述在云南省昭通市采集健康人群的另一支鼻咽拭子,立即运送回实验室（4h内）。在含有600μl 0.85%生理盐水的Eppendorf管中反复捻动洗脱50-80次,保证拭子残留物充分洗脱至洗脱液中后,将洗脱液12,000rpm离心5min,去除上清,加入100μl去离子水于100℃金属浴中加热10min,将洗脱液12,000rpm离心5min,取上清液应用荧光定量PCR检测CT值,于-80℃中保存。2 疑似百日咳病例样本:样本为2018年8月-2019年3月在中国疾病预防控制中心细菌性疾病监测点一河北省儿童医院采集的疑似百日咳病例的口咽拭子,将口咽拭子在含有600μl 0.85%生理盐水的Eppendorf管中反复捻动洗脱50-80次,保证拭子残留物充分洗脱后,将洗脱液12,000rpm离心5min,去除上清,按照QIAamp DNA mini kit试剂盒说明书提取样品DNA,于-80℃中保存。3.2.2 样品检测应用qPCR检测3.2.1中健人群样本和疑似百日咳病例样本的CT值。以qPCR方法的检测下限作为健康人群无症状百日咳的判断标准,即样本CT值<38判断为阳性。以世界卫生组织推荐的CT<35作为疑似百日咳病例样本的阳性判断标准。3.3 基于微滴式数字PCR技术的百日咳鲍特菌检测方法3.3.1 建立方法通过优化退火温度、引物和探针浓度系统建立基于微滴式数字PCR技术（ddPCR）的百日咳鲍特菌检测方法。3.3.2评价方法应用我国临床常见呼吸道细菌的DNA评价该方法的特异性;应用10倍倍比稀释的单拷贝基因IS481质粒参考品来评价该方法的灵敏性和准确性;应用10倍倍比稀释的百日咳鲍特菌DNA来评价该方法的重复性。3.4 ddPCR方法与细菌培养方法、qPCR方法对百日咳鲍特菌定量的比较制备百日咳鲍特菌菌悬液UV600=0.5O.D,经逐级10倍稀释后,取100μl于木炭琼脂培养基连续培养,5d统计菌落数（CFU/μl）;应用QIAamp DNA mini kit试剂盒提取百日咳鲍特菌菌悬液（UV600=0.5O.D）的DNA,DNA逐级10倍稀释后应用ddPCR与qPCR分别检测,比较三种方法对百日咳鲍特菌的定量结果。3.5 ddPCR方法在健康人群和临床中的应用分别应用ddPCR和qPCR方法检测健康人群鼻咽拭子样本和疑似百日咳病例的口咽拭子样本。4数据处理与统计学分析qPCR方法（CT值）和ddPCR方法（copies/μl）的检测结果,用平均数和标准差表示;组内重复性和组间重复性用变异系数CV表示;通过线性回归分析ddPCR结果与细菌培养结果的相关性、ddPCR结果的对数值与qPCR结果的相关性,并计算直线相关系数R2;qPCR方法和ddPCR方法的检出率一致性应用Cohen’s kappa系数表示,两种方法检出率之间的比较采用配对卡方检验。P<0.05为存在统计学差异。研究结果1 本研究建立了基于ddPCR技术的百日咳鲍特菌检测方法,其优化的退火温度为51.1℃,引物浓度为400nM,探探针浓度为200nM,并对其灵敏性、特异性、准确性和重复性进行评价。结果显示,对脑膜炎耐瑟菌（Nm）、肺炎链球菌（Sp）、流感嗜血杆菌（Hi）、支气管败血鲍特菌（Bb）以及去离子水（NTC）的检测结果均为阴性,无非特异性扩增;该ddPCR方法的检测最低下限为1 copy/反应;组内、组间重复性的CV分别为1.62%和0.89%;ddPCR检测范围为六个数量级,在质粒参考品4.0 copies/μl-4.0×104copies/μl浓度范围内,目的基因理论拷贝数与数字PCR检测出的拷贝数成直线线性相关且R2=0.9998。2在检测健康人群百日咳鲍特菌的应用中,依据ddPCR最低检测下限（1copy/反应）作为ddPCR检测无症状百日咳的判断标准:CT<35的4份样品、35≤CT<38的7份样品、38≤CT<40的7份样品全部检测出阳性液滴,≥40的20份样品中11份检测出阳性液滴,ddPCR方法的检出率达到76.32%（29/38）;以qPCR方法的检测下限（CT值为38）作为qPCR检测无症状百日咳的判断标准,qPCR方法检测出的阳性率为28.95%（11/38）,细菌培养方检测菌落数阳性结果为0。3在检测疑似百日咳临床病例的应用中,ddPCR结果为:CT<35的40份样品均检测出阳性液滴,35≤CT<38的26份样品中25份检测出阳性液滴,38≤CT<40的9份样品中8份检测出阳性液滴,CT≥40的12份样品中5份检测出阳性液滴。根据构建的qPCR标准曲线,估算出CT为35时对应29.4 copies/μl,当以CT<35和样本初始浓度>29.4 copies/μl分别作为qPCR和ddPCR方法诊断百日咳的标准,ddPCR方法阳性率为51.72%（45/87）,而qPCR的阳性率为45.98%（40/87）,两种方法的Cohen’s Kappa值为0.89,具有高强度的一致性,差异无统计学意义（P=0.063）。研究结论1系统建立了基于QX200微滴式数字PCR技术的百日咳鲍特菌的检测方法的特异性好、准确性好,比传统的细菌培养法、荧光定量PCR方法更灵敏。2微滴式数字PCR方法比细菌培养方法、荧光定量PCR方法更灵敏,更适合健康人群无症状百日咳的检测,为无症状百日咳检测提供了一种新方法。3微滴式数字PCR法在临床样本检测中与荧光定量PCR法有着高度一致性,但灵敏性更高,能够应用于百日咳鲍特菌的实验室诊断,提高检测率,发现更多的百日咳感染者。4可基于微滴式数字PCR技术建立其他呼吸道常见细菌例如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌等检测方法。
张丙周[6]（2020）在《副猪嗜血杆菌LuxS/AI-2群体感应系统研究》文中研究说明猪细菌性疾病是一类由多种细菌性病原引起的疾病,其病原具有种类众多、血清型多、毒力因子复杂、传播能力强、耐药问题突出以及多种病原混合感染等特点,严重危害着我国猪群的健康。病原感染具有明显的时空分布,开展病原学调查有助于制定准确防的控策略。近些年,由于抗生素滥用导致的耐药问题愈发严重,细菌病防控也变得越来越困难,逐渐成为限制我国养殖业发展的关键因素,建立在敏感药物筛选基础上的合理用药可有效防控疾病,且提升猪产品的食用安全性。副猪嗜血杆菌是临床上危害猪群健康最严重的细菌性病原之一,能够引起猪只多发性浆膜炎、脑膜炎、支气管肺炎和关节炎等临床疾病,其致病因子众多,致病机制复杂。因此,副猪嗜血杆菌详细的致病机制仍然有待深入研究。群体感应系统是一种调控细菌自身功能与细菌之间信号交流的重要功能系统,对细菌生理特性、生物膜形成、细菌耐药性和毒力等特性的调节发挥着重要的作用,但并未见其在副猪嗜血杆菌中的报道。因此,本试验开展了群体感应系统与副猪嗜血杆菌致病机制的研究,希望为副猪嗜血杆菌病防控提供新思路。本研究首先调查了我国猪场常见细菌性病原的流行情况,并分析了其流行规律和耐药现状;然后以副猪嗜血杆菌为研究对象,阐述了群体感应系统与副猪嗜血杆菌生物学功能、生物膜形成和毒力等特性的相关性;进一步利用RNA-Seq技术研究了群体感应系统导致副猪嗜血杆菌特性变化的可能机制;最后发现了群体感应系统调节副猪嗜血杆菌抵抗热应激的可能分子机制和群体感应系统AI-2分子的受体蛋白Rbs B1。主要研究结果如下:1.猪场细菌性病原的流行特征及耐药性研究为了给猪场常见细菌病提供有效的防控指导,试验调查分析了我国猪场常见细菌性病原及其流行规律和耐药机制。2013-2017年,从全国16个不同省份的9661个猪场收集了44,175份临床样品。通过细菌分离鉴定,可知存在于我国猪场的主要细菌性病原有猪链球菌（38.0%）、副猪嗜血杆菌（21.9%）、多杀性巴氏杆菌（7.7%）、致病性大肠杆菌（14.4%）、胸膜肺炎放线杆菌（0.7%）、支气管败血波氏杆菌（3.4%）、沙门氏菌（5.1%）和红斑丹毒丝菌（2.0%）。其中猪链球菌（15.3%-18.6%）、致病性大肠杆菌（4.3%-9.9%）、胸膜肺炎放线杆菌（0.1%-0.5%）和沙门氏菌（1.6%-3.7%）的分离率呈现逐年增高的趋势,而副猪嗜血杆菌（11.6%-7.3%）和红斑丹毒丝菌（1.6%-0.6%）的分离率则出现了一定的下降,但是猪链球菌和副猪嗜血杆菌仍然是我国猪场分离率最高的两种细菌性病原。血清型分型结果显示,猪链球菌的最主要血清型仍然为血清2型,但血清2型菌株的分离率自2013年至2017年减少了约20%;副猪嗜血杆菌的流行优势血清型则由血清4型变为血清5型。季节性流行特征结果显示猪链球菌和副猪嗜血杆菌在炎热季节分离率较高,而多杀性巴氏杆菌则在2-4月份及10月份分离率较高。细菌耐药性试验结果显示,猪链球菌、副猪嗜血杆菌和多杀性巴氏杆菌对常见的8种类型（氨基糖苷类、大环内酯类、林可霉素类、四环素类、多粘菌素,磺胺类,β-内酰胺类和喹诺酮类抗生素）抗生素均表现出了较高的耐药率,而且多数细菌耐药率呈现出了逐年增高的现象。2.副猪嗜血杆菌Lux S/AI-2群体感应系统的功能研究通过分析不同菌株的基因组,发现群体感应系统广泛存在于多数细菌之中。为了探索群体感应系统对副猪嗜血杆菌的调控作用,构建了副猪嗜血杆菌的lux S基因缺失株（Δlux S）和互补菌株（C-lux S）,并利用亲本菌株和这两株重组菌株比较分析了群体感应系统对副猪嗜血杆菌在生长特性、生物膜形成和毒力的影响。结果发现,副猪嗜血杆菌群体感应系统缺失后,其抵抗热应激和氧化应激的能力分别减弱了23.0%和25.7%,不同温度下细菌自身凝集能力和凝集红细胞的能力极显着减弱,粘附PK-15细胞的能力下降了约117倍,对小鼠的致病力下降约10倍,在小鼠不同组织的定植能力也均显着减弱,但是细菌抵抗渗透压应激的能力增强了23.7%,生物膜形成能力也显着增强。因此,群体感应系统广泛参与了副猪嗜血杆菌多种生理功能的调节。3.副猪嗜血杆菌群体感应系统缺失株转录组学研究在副猪嗜血杆菌生长的稳定期前期收集了HPS2、Δlux S和C-lux S菌株,提取RNA后,去除宿主DNA。经RNA-Seq测序,获得了HPS2、Δlux S和C-lux S菌株转录样本的大量Reads。再通过数据过滤、序列比对和转录差异基因的富集等分析发现,与HPS2菌株相比,Δlux S菌株出现了232个上调表达基因和212个下调表达基因,主要参与了碳代谢、RNA降解、三羧酸循环（TCA）等生物过程和转运、多种蛋白水解酶活性、离子跨膜运输、跨膜信号接收和信号受体活性等生物功能。同时,转录组学结果显示群体感应系统参与了副猪嗜血杆菌抵抗热应激的可能分子机制以及发现了参与群体感应系统功能调节的rbs B1基因。4.群体感应系统调控副猪嗜血杆菌抵抗热应激的研究HPS2、Δlux S和C-lux S菌株的转录组学结果显示,参与HPS热应激调节的多种基因均出现了转录水平的差异表达。本试验利用定量检测的方法,验证了这些基因的转录水平。结果发现,与HPS2菌株相比,Δlux S菌株的rse A基因出现了显着的转录上调,rpo E,rse B,deg S,clp P和htr A基因出现了显着的转录下调,初步验证了副猪嗜血杆菌利用群体感应系统调控htr A基因的转录水平,进而调控其抵抗热应激的分子机制。为了进一步验证rse A和rpo E基因在调控副猪嗜血杆菌热应激中的作用,构建了副猪嗜血杆菌Δrse A和Δrpo E基因缺失株,证明了在副猪嗜血杆菌调控热应激中的rse A和rpo E基因分别发挥了负向调控作用和正向调控作用。5.受体蛋白Rbs B1在副猪嗜血杆菌群体感应系统中的作用HPS2、Δlux S和C-lux S菌株的转录组结果也显示,与HPS2菌株相比,Δlux S菌株的rbs B1基因出现了显着的表达下调。通过同源序列分析发现,副猪嗜血杆菌的rbs B1基因与具有群体感应系统的放线共生放线杆菌（IDH781菌株）以及流感嗜血杆菌（86-028NP菌株）rbs B1基因序列同源性分别高达72.4%和73.3%。因此,我们猜测rbs B1基因在副猪嗜血杆菌中可能发挥着与放线共生放线杆菌和流感嗜血杆菌的rbs B1基因类似的功能。试验利用构建的副猪嗜血杆菌rbs B1基因缺失株Δrbs B1和原核表达蛋白Rbs B1,证明了Rbs B1蛋白为副猪嗜血杆菌群体感应系统中AI-2分子的受体蛋白。试验结果显示,AI-2分子的浓度在Δrbs B1菌中的降低速度显着低于HPS2亲本菌株,而且AI-2分子的吸收与转运与Rbs B1蛋白的含量之间存在剂量依赖关系。该发现进一步完善了副猪嗜血杆菌群体感应系统的调控通路。综上所述,本文发现了2013-2017年我国部分猪场中常见细菌性病原的感染特点、耐药现状,为细菌病防控提供了参考;发现副猪嗜血杆菌存在群体感应系统,且该系统与副猪嗜血杆菌自身多种重要特性的改变密切相关;阐明了副猪嗜血杆菌抵抗热应激的可能分子机制以及发现了群体感应系统的受体蛋白,该研究为群体感应系统的深入研究奠定了基础。
邢小微[7]（2019）在《宏基因组高通量测序对中枢神经系统感染性疾病的诊断价值研究》文中提出目的:1.分析宏基因组高通量测序技术诊断病毒性脑（膜）炎、结核性脑膜炎、化脓性脑膜炎和隐球菌性脑膜炎的敏感度和特异度等指标;2.分析不同的Unique reads条数在鉴别中枢神经系统感染性疾病中的作用;3.分析不同检测时间对宏基因组高通量测序检测结果的影响;4.分析感染累及不同部位时,选择不同样本进行宏基因组高通量测序对诊断结果的影响。方法:2016年11月～2019年2月共计201例患者纳入本研究,包括70例病毒性脑（膜）炎、39例结核性脑膜炎、38例化脓性脑膜炎、24例真菌性脑膜炎和30例对照组。在常规诊治操作中留取脑脊液或血液标本,进行DNA提取和文库构建。将质控合格的文库进行BGISEQ-500/50测序,经过生物信息分析后生成测序数据,根据患者临床信息判读致病体。根据患者临床信息及其他辅助检查结果,形成最终诊断。计算高通量测序对中枢神经系统感染性疾病的诊断敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等指标。比较在不同的Unique reads条数标准下,高通量测序对中枢神经系统感染性疾病的诊断效能。结果:1.在确诊的病毒性脑（膜）炎患者中,当Unique reads≥ 2时,高通量测序诊断病毒性脑（膜）炎的ROC曲线下面积（0.651）最大,NGS诊断的阳性一致百分比,阴性一致百分比和总一致百分比分别为40.8%,89.3%和76.1%。当感染仅累及脑（脊）膜时,脑脊液组高通量测序阳性率（100%）高于血液组（60%）,脑脊液组Unique reads、基因覆盖度均高于血液组,p<0.05。当感染累及脑实质时,脑组织NGS的Unique reads、基因覆盖度均高于脑脊液标本。2.在确诊和很可能的结核性脑膜炎患者中,当种水平序列数≥1时,ROC曲线下面积（0.610）最大,NGS诊断的阳性一致百分比、阴性一致百分比和总一致百分比分别为25.6%,96.3%和82.6%。在金标准确诊的结核性脑膜炎患者中,NGS诊断的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为60%、96.3%、33.3%和98.7%。将高通量测序与常规检测方法结合时,结核性脑膜炎的诊断阳性率为61.54%（24/39）。3.在金标准确诊的化脓性脑炎中,当Unique reads条数≥ 5时,ROC曲线下面积（0.892）最大,NGS敏感度为83.3%,特异度为95.1%,阳性预测值为55.6%,阴性预测值为98.7%。4.当Uniquereads条数≥2时,NGS诊断隐球菌性脑炎的敏感度为75%,特异度为99.47%,阳性预测值为90%,阴性预测值为98.43%。结论:1.（1）建议将Uniquereads≥2作为NGS检测病毒感染的阳性标准;（2）推荐在病毒性脑（膜）炎发病早期进行高通量测序检测;（3）当感染累及脑膜时,选择脑脊液进行NGS诊断价值优于血液。2.（1）当NGS检出结核分枝杆菌复合群时,建议至少一条以上序列可匹配到种或属时,可作为阳性结果;（2）NGS对结核性脑膜炎的诊断能力尚有待进一步提高,目前可作为一种辅助诊断手段,并可作为排他性诊断方法之一。3.（1）建议将Unique reads数≥5定义为NGS检测化脓性脑膜炎的阳性标准;（2）化脓性脑膜炎的NGS结果较为纷繁复杂,对病原菌和背景污染菌的鉴别是目前的难题。4.（1）NGS对隐球菌性脑膜炎的诊断能力低于常规检测方法;（2）NGS可鉴别隐球菌菌种,有助于隐球菌性脑膜炎的诊治管理;（3）建议早期联合墨汁染色、真菌培养、荚膜抗原检测及高通量测序多种方法,以期早期、精准诊断,为抗感染治疗方案及疗程的选择提供依据。5.（1）尽管NGS对病毒性脑（膜）炎和结核性脑膜炎的诊断能力一般,但在目前临床诊断的困境中,无疑是很有意义的检测手段。（2）NGS对化脓性脑膜炎和隐球菌性脑膜炎的诊断能力较好;（3）临床医生应根据临床各方面证据结合高通量测序结果综合判定病原体。
段芃嫄[8]（2019）在《社区获得性肺炎分子诊断方法的建立及初步应用》文中提出[目的]初步建立社区获得性肺炎（CAP）的分子诊断方法,并对云南省大理市某医院的肺炎病例的分布进行初步调查,以大致了解其致病病原谱,为临床诊治提供一定的参考依据。[方法]1.实时荧光定量PCR（qPCR）引物设计与组合:对已知的单色细菌（包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、卡他莫拉菌、流感嗜血杆菌6种细菌）和非典型病原引物（嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体3种非典型病原）引物进行组合配对,并将组合与单色引物进行比较。比较已知CAP常见病毒的引物,常见病毒有6种（14个亚型）病毒（呼吸道合胞病毒A、B型,副流感病毒1-4型,人偏肺病毒,博卡病毒,甲、乙型流感病毒,冠状病毒 OC43、NL63、229E、HKU1）。2.收集呼吸道标本:将大理市某医院2017年2月-2018年3月间诊断为“社区获得性肺炎”的入院病人作为调查对象,采集其呼吸道标本,包括痰、肺泡灌洗液、胸水。3.呼吸道标本预处理:痰液标本经胰蛋白酶消化,肺泡灌洗液和胸水则直接使用下层沉淀。4.呼吸道病原检测:对428份呼吸道标本进行6种细菌、3种非典型病原和6种（14个亚型）病毒的qPCR检测。5.病例信息收集:以标本号查找对应住院号,获取病例基本信息、临床症状、体格检查、实验室检查结果、影像学表现等信息,去掉出院诊断为“肺结核”、“肺肿瘤”的病例。6.对数据进行统计和分析:用SPSS 17.0对数据进行处理,统计主要方法为χ2检验,检验水准α=0.05。[结果]1.引物确定:比较细菌单色引物与组合引物及病毒单色引物与双色引物对同一阳性对照的CT值,细菌组合引物与单色引物CT值差异不大,病毒（除冠状病毒外）双色引物比单色引物灵敏度高,冠状病毒单色引物较为灵敏。确定检测呼吸道标本中的细菌及非典型病原使用组合引物,病毒检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人偏肺病毒、博卡病毒、流感病毒使用双色引物,而冠状病毒则仍以单色引物进行检测。2.CAP病例感染情况:428份标本共170例病例。170例病例中,qPCR结果合并医院分离培养结果,细菌感染为13.53%,病毒感染率为22.94%,非典型病原（肺炎支原体）感染率为3.53%,真菌（白色念球菌）感染率为4.71%,混合感染为28.82%。3.病例感染情况:CAP细菌感染以流感嗜血杆菌为主,病毒主要为甲、乙型流感病毒,嗜肺军团菌与肺炎衣原体未检出,有部分病例为真菌性肺炎。[结论]初步建立了针对23种（型）病原的CAP的分子诊断方法,并进行了组合。初步阐明大理市某医院CAP病例感染情况,细菌以流感嗜血杆菌为主,病毒多为流感病毒,并存在一定比例的支原体肺炎和真菌性肺炎,混合感染也应引起重视。
王琨[9]（2019）在《苏州地区住院儿童百日咳的临床流行病学及其特征的研究》文中认为目的探讨苏州地区住院儿童百日咳临床流行病学特点及其特征,以及百日咳与类百日咳患儿临床差异。方法收集2017年2月至2018年7月,在苏州大学附属儿童医院呼吸科收治住院的呼吸道感染患儿的呼吸道分泌物,应用Real-time PCR检测百日咳杆菌双目标基因及多病原学检测,包括痰细菌培养,直接免疫荧光法检测痰呼吸道常见七种病毒。同时采集外周静脉血行血常规、血清肺炎支原体抗体等检查。收集并整理入选患儿的临床资料,比较不同年龄、季节、是否合并其他病原体感染的临床流行病学及特征等,采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理。计数资料以百分比表示,使用卡方检验。计量资料符合正态分布者,以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析;偏态分布者以中位数（四分位数间距）表示,组间比较采用秩和检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果（一）苏州地区住院儿童百日咳的临床流行病学1.共检测1769例,根据临床症状及百日咳杆菌PCR检测结果,阳性患儿154例（8.71%）,其中男性 89 例（57.80%）,女性 65 例（42.20%）。2.≤3月龄、～1岁、～3岁、>3岁年龄组检出率分别为9.74%、13.95%、5.35%、3.17%,其中3月龄～1岁患儿检出率明显高于其他年龄组,差异具有统计学意义（χ2=42.226，P<0.001）。3.春、夏、秋、冬四季检出率分别为8.91%（55/617）、13.64%（63/462）、5.21%（17/326）、5.22%（19/364），夏季检出率最高,差异具有统计学意义（χ2=24.73,P<0.001）,并且夏季与秋季,夏季与冬季比较有统计学差异（χ2分别为:14.861、16.129，P 值均<0.01）。4.在154例阳性患儿中,有96例（62.34%）合并有其他病原体感染,支原体感染有21例（13.64%）,64例（41.56%）混合病毒感染,其中鼻病毒有38例,副流感3型病毒有7例,博卡病毒16例,呼吸道合胞病毒有3例,副流感1型病毒1例,流感病毒A有2例;混合细菌感染共33例（21.42%）,其中混合肺炎链球菌有14例,混合流感嗜血杆菌感染有12例,卡他莫拉菌有3例,肺炎克雷伯杆菌2例。（二）苏州地区住院儿童百日咳临床特点分析1.154例百日咳双重PCR阳性患儿中,≤3月龄、～1岁、～3岁、>3岁分别占24.7%（38/154）、53.9%（83/154）、13.0%（20/154）、8.4%（13/154）,其中以3月龄～1岁比例最高（χ2=42.226,P<0.001）。2.百日咳患儿以阵发性痉咳（76%）、面色涨红（64.9%）、咳后呕吐（22.3%）、阵发性青紫（16.2%）和鸡鸣样回声（10.4%）为主要表现。3.百日咳PCR检测阳性患儿中,未接种百日咳疫苗（部分接种及完全未接种）的有128例（83.1%）,百日咳疫苗接种完全的有26例（16.9%）,未免疫组患儿发生痉挛样咳嗽（81.2%,50%）及面色涨红（68.8%,46.2%）高于完全免疫组患儿,差异具有统计学意义（χ2分别为11.56、4.85,P值分别为0.01、0.03）。4.百日咳单纯感染与混合感染两组比较,鸡鸣样回声、阵发性青紫、咳后呕吐、重症肺炎、白细胞及淋巴细胞绝对值以及住院天数均无明显统计学差异（P>0.05）。5.百日咳组及类百日咳组比较,类百日咳组的鸡鸣样回声（22.7%）及面色涨红（85.3%）多于百日咳组（10.4%及64.9%）（χ2分别为6.16、10.32，P值分别为0.01、0.00），但百日咳组的白细胞（15.56×109/L）及淋巴细胞计数（9.63×109/L）均高于类百日咳组（11.97×109/L及7.82×109/L）（Z值分别为-2.71、-1.99,P值分别为0.007、0.046）。6.共75例类百日咳患儿中,3例（4%）检出肺炎支原体感染,16例（21.3%）检出鼻病毒感染,7例（9.3%）副流感3病毒感染,6例（8%）博卡病毒感染,3例（4%）呼吸道合胞病毒感染,流感嗜血杆菌感染有8例（10.7%）,肺炎链球菌感染有6例（8%）。结论1.苏州地区儿童百日咳杆菌感染并不少见,且3月龄～1岁儿童百日咳检出率最高。2.百日咳全年散发,夏季为检出高峰。3.百日咳患儿易合并其他病原菌感染。4.未进行百日咳免疫接种的患儿,其临床表现更加典型。5.人鼻病毒、副流感病毒3病毒、博卡病毒是引起类百日咳的主要病原。6.单纯从临床表现不能区别百日咳与类百日咳,但百日咳患儿的白细胞及淋巴细胞计数明显高于类百日咳,可作为临床初步判断依据。
邹迁达[10]（2019）在《浙江省流感重症肺炎临床特点及甲型H1N1pdm09流感病毒血凝素与神经氨酸酶基因特征分析》文中进行了进一步梳理目的:了解浙江省流感重症肺炎的临床特点及甲型H1N1pdm09流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）与神经氨酸酶（neuraminidase,NA）的基因特征。方法:1.选取2017年8月至2018年5月浙江省14家合作医院流感重症肺炎的病例进行回顾性分析,探究死亡危险因素、评估抗病毒治疗方案、分析继发感染病原菌检出情况。统计资料以SPSS v22.0进行分析。2.收集2017年8月至2018年5月浙江大学医学院附属第一医院甲型H1N1pdm09流感病毒阳性标本。收集患者临床信息,依据病情分为重症肺炎组、轻症肺炎组和无肺炎组进行比较。采用RT-PCR法对甲型H1N1pdm09流感病毒HA与NA基因进行扩增及测序,运用DNAStar v7.2进行基因序列比对与同源性分析,TREESUB、RAxML v8.2和PAML v4.9构建系统进化树。结果:1.2017年8月至2018年5月,14家合作医院共报告流感阳性住院病例5820例,其中流感重症肺炎248例（4.3%）,死亡99例（1.7%）。2017年8～9月出现住院小高峰,2018年1～2月达高峰。Logistic回归分析示,咯血（OR 6.537;95%CI:1.185-35.953;P=0.031）、急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）（OR 3.577;95%CI:1.417-9.026;P=0.007）、感染性休克（OR 14.863;95%CI:5.072-43.551;P<0.001）和白细胞计数升高（OR 1.104;95%CI:1.025-1.190;P=0.009）是流感重症肺炎死亡的危险因素,神经氨酸酶抑制剂（neuraminidase inhibitor,NAI）治疗是保护因素（OR 0.067;95%CI:0.006-0.803;P=0.033）。2.生存分析示,接受NAI治疗患者60天存活率显着高于未接受NAI治疗患者（63.0%vs.7.7%,P<0.001）;双倍剂量奥司他韦（300 mg/d）治疗患者60天存活率显着高于单倍剂量奥司他韦（150 mg/d）治疗患者（68.3%vs.54.4%,P=0.025）。奥司他韦、帕拉米韦单药治疗与奥司他韦-帕拉米韦联合治疗,以及帕拉米韦不同剂量治疗对患者60天存活率的影响差异无统计学意义（P>0.050）。3.共63例（25.4%）流感重症肺炎患者出现继发感染,常见于发病后2～3周。鲍曼不动杆菌（47.6%）、曲霉菌属（20.6%）、肺炎克雷伯菌（17.5%）和金黄色葡萄球菌（11.1%）是最常检出的病原菌,耐药病原菌占57.1%。4.重症肺炎、轻症肺炎和无肺炎组甲型H1N1pdm09流感病毒HA和NA基因与疫苗株A/Michigan/45/2015具有高度同源性（≥98.0%）。HA基因系统发育分析示,所有病毒株均属于6B.1A进化枝,重症肺炎组多集中于同一亚枝（HA S183P）,轻症肺炎组和无肺炎组则散在分布于各亚枝。5.甲型H1N1pdm09流感病毒HA基因分析示,重症肺炎组受体结合位点D222G/N/S突变检出率为23.1%,轻症肺炎组与无肺炎组中未检出,重症肺炎组与轻症肺炎组（P=0.010）、肺炎组与无肺炎组（P=0.004）之间的比较差异有统计学意义。6.甲型H1N1pdm09流感病毒NA基因分析示,重症肺炎组耐药位点H275Y突变检出率为14.0%,轻症肺炎组与无肺炎组中未检出,肺炎组与无肺炎组之间的比较差异有统计学意义（P=0.038）。结论:1.流感重症肺炎患者病死率高,咯血、ARDS、感染性休克和白细胞计数升高是其死亡危险因素,临床应予以重视。2.流感重症肺炎患者应及时予以NAI治疗,必要时予双倍剂量奥司他韦治疗。3.流感重症肺炎患者发病后2～3周易出现继发感染,其病原菌构成多样,耐药比例高,应及时对该类患者进行细菌与真菌学检查。4.甲型H1N1pdm09流感病毒HA基因受体结合位点D222G/N/S变异和NA基因耐药位点H275Y变异与流感重症肺炎相关,建议对这些特殊变异位点进行监测。
二、流感嗜血杆菌实验室诊断存在的问题与展望（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、流感嗜血杆菌实验室诊断存在的问题与展望（论文提纲范文）
（2）副猪嗜血杆菌病研究进展（论文提纲范文）
| 1 副猪嗜血杆菌的致病机理研究 |
| 1.1 血清型 |
| 1.2 致病机制与毒力因子 |
| 2 副猪嗜血杆菌的实验室诊断研究 |
| 2.1 细菌分离鉴定 |
| 2.2 血清学诊断 |
| 2.3 分子生物学检测 |
| 3 副猪嗜血杆菌病疫苗的研究 |
| 3.1 灭活疫苗 |
| 3.2 亚单位疫苗 |
| 3.3 菌影疫苗 |
| 4 展望 |
（3）2016-2018年北京市流感共感染病原谱研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第1章 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 一般资料 |
| 1.1.2 选择标准 |
| 1.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 主要仪器及耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 样品核酸的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR扩增 |
| 1.2.3 结果判读 |
| 1.2.4 数据结果验证 |
| 1.2.5 数据处理 |
| 第2章 结果 |
| 2.1 数据背景分析 |
| 2.2 检出呼吸道病原体的分布 |
| 2.3 流感病毒(IV)单独感染及共感染 |
| 2.4 与流感病毒(IV)共感染的病原体种类、数量、分布 |
| 2.4.1 与流感病毒(IV)共感染的病原体种类 |
| 2.4.2 与流感病毒(IV)共感染的病原体数量 |
| 2.5 流感病毒(IV)共感染 |
| 2.5.1 流感病毒(IV)合并病毒感染 |
| 2.5.2 流感病毒(IV)合并细菌感染 |
| 2.6 与流感病毒(IV)共感染的病原体分布 |
| 2.6.1 与甲型流感病毒(IVA)共感染的病原体分布 |
| 2.6.2 与乙型流感病毒(IVB)共感染的病原体分布 |
| 2.6.3 甲型流感病毒(IVA)与乙型流感病毒(IVB)共感染情况比较 |
| 2.7 共感染与年龄的关系 |
| 2.7.1 共感染发生率与年龄的关系 |
| 2.7.2 共感染病原体数目与年龄的关系 |
| 2.7.3 病原体分布与年龄的关系 |
| 2.7.4 少儿组年龄分布及病情程度分布 |
| 2.8 共感染与性别的关系 |
| 2.8.1 共感染发生率与性别的关系 |
| 2.8.2 共感染病原体数目与性别的关系 |
| 2.8.3 病原体分布与性别的关系 |
| 2.9 共感染与症状严重程度的关系 |
| 2.9.1 轻症肺炎和重症肺炎的共感染发生率 |
| 2.9.2 轻症肺炎和重症肺炎的共感染病原体数目 |
| 2.9.3 病原体分布与症状严重程度的关系 |
| 2.10 共感染与时间的关系 |
| 2.10.1 共感染与季节的关系 |
| 2.10.2 共感染与年份的关系 |
| 2.11 荧光定量PCR病原检测结果验证 |
| 第3章 讨论 |
| 3.1 甲型和乙型流感病毒感染的特点 |
| 3.2 流感病毒共感染率较高的病原体的特点 |
| 3.3 流感共感染与年龄的关系 |
| 3.4 流感共感染与时间的关系 |
| 第4章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（4）副猪嗜血杆菌脂多糖刺激猪肺泡巨噬细胞引起NLRP3的变化及其对NF-κB信号通路的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 副猪嗜血杆菌的概述 |
| 1.2 副猪嗜血杆菌的病原型态及培养特性 |
| 1.3 副猪嗜血杆菌的血清学研究进展 |
| 1.3.1 血清学分型 |
| 1.3.2 分子生物学分型 |
| 1.4 副猪嗜血杆菌致病机制 |
| 1.4.1 副猪嗜血杆菌的毒力因子 |
| 1.4.2 副猪嗜血杆菌逃避肺部的天然免疫 |
| 1.5 副猪嗜血杆菌的临床症状及病理变化 |
| 1.6 副猪嗜血杆菌诊断 |
| 1.7 副猪嗜血杆菌的防控 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 试验相关设备仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 副猪嗜血杆菌脂多糖的提取、鉴定和保存 |
| 2.2.2 NLRP3 抑制剂对副猪嗜血杆菌脂多糖刺激PAM细胞IL-1β表达量的影响 |
| 2.2.3 TLR4 对副猪嗜血杆菌脂多糖刺激PAM细胞NF-κB信号通路的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 副猪嗜血杆菌脂多糖的提取、鉴定和保存 |
| 3.1.1 副猪嗜血杆菌脂多糖的纯化结果 |
| 3.1.2 副猪嗜血杆菌脂多糖的定性试验结果 |
| 3.1.3 副猪嗜血杆菌脂多糖中多糖含量测定 |
| 3.1.4 副猪嗜血杆菌脂多糖的核酸含量测定 |
| 3.1.5 副猪嗜血杆菌脂多糖的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果 |
| 3.1.6 副猪嗜血杆菌脂多糖的银染鉴定结果 |
| 3.2 NLRP3 抑制剂对副猪嗜血杆菌脂多糖刺激PAM细胞IL-1β表达量的影响 |
| 3.2.1 IL-1β、NLRP3 表达量结果与分析 |
| 3.3 TLR4 对副猪嗜血杆菌脂多糖刺激PAM细胞NF-κB信号通路的影响 |
| 3.3.1 细胞质中IκB、p65 表达量结果与分析 |
| 3.3.2 细胞质中p-IκB、p-p65 表达量结果与分析 |
| 3.3.3 细胞核中p-p65 表达量结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 副猪嗜血杆菌脂多糖的提取、鉴定和保存 |
| 4.2 NLRP3 抑制剂对副猪嗜血杆菌脂多糖刺激PAM细胞IL-1β表达量的影响 |
| 4.3 TLR4 对副猪嗜血杆菌脂多糖刺激PAM细胞NF-κB信号通路的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 参与课题情况 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论着 |
（5）基于微滴式数字PCR技术的百日咳鲍特菌检测方法的建立、评价与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究目的和技术路线图 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论与建议 |
| 局限性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）副猪嗜血杆菌LuxS/AI-2群体感应系统研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪场细菌性疾病概述 |
| 1.1.1 我国猪细菌性疾病的流行特点 |
| 1.1.2 猪链球菌病 |
| 1.1.3 副猪嗜血杆菌病 |
| 1.1.4 猪萎缩性鼻炎 |
| 1.1.5 猪大肠杆菌病 |
| 1.1.6 猪传染性胸膜肺炎 |
| 1.1.7 仔猪副伤寒 |
| 1.1.8 猪丹毒 |
| 1.2 细菌耐药性概述 |
| 1.2.1 细菌耐药现状 |
| 1.2.2 细菌耐药机制 |
| 1.2.2.1 由细菌膜和外排泵介导的耐药 |
| 1.2.2.2 抗生素结构的改变 |
| 1.2.2.3 抗生素作用靶点改变 |
| 1.2.2.4 细菌状态改变 |
| 1.2.3 减少细菌耐药性的策略 |
| 1.3 细菌群体感应系统概述 |
| 1.3.1 群体感应系统简介 |
| 1.3.2 Lux S/AI-2 群体感应系统 |
| 1.3.3 群体感应系统与细菌生物膜 |
| 1.3.4 群体感应系统与细菌的环境压力应激 |
| 1.3.5 群体感应系统与细菌毒力 |
| 1.3.6 群体感应系统的受体分子 |
| 1.3.7 群体感应系统的临床意义 |
| 1.4 转录组学技术研究及应用 |
| 1.4.1 转录组学概述 |
| 1.4.2 RNA-Seq在转录组学研究中的应用 |
| 1.5 细菌热应激调控的分子机制 |
| 1.6 立题依据 |
| 第二章 猪场病原菌感染调查及耐药性研究 |
| 2.1 研究的目的与意义 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 培养基的配置 |
| 2.2.4 PCR引物 |
| 2.2.4.1 细菌鉴定引物 |
| 2.2.4.2 猪链球菌分型引物 |
| 2.2.4.3 副猪嗜血杆菌分型引物 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 样品收集 |
| 2.3.2 细菌分离 |
| 2.3.3 PCR鉴定 |
| 2.3.3.1 细菌种属的PCR鉴定 |
| 2.3.3.2 猪链球菌和副猪嗜血杆菌的血清型鉴定 |
| 2.3.4 药敏试验 |
| 2.3.5 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 样品来源的地区分布 |
| 2.4.2 样品的组织种类 |
| 2.4.3 病原菌的组成及分离率 |
| 2.4.4 猪链球菌、副猪嗜血杆菌和多杀性巴氏杆菌的季节性分布 |
| 2.4.5 猪链球菌和副猪嗜血杆菌的血清型 |
| 2.4.6 猪链球菌、副猪嗜血杆菌和多杀性巴氏杆菌的耐药性 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 样品信息分析 |
| 2.5.2 病原菌的流行特点分析 |
| 2.5.3 猪链球菌、副猪嗜血杆菌和多杀性巴氏杆菌的季节性感染特点 |
| 2.5.4 猪链球菌的副猪嗜血杆菌的血清型特征 |
| 2.5.5 猪链球菌、副猪嗜血杆菌和多杀性巴氏杆菌的耐药率比较 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 副猪嗜血杆菌Lux S/AI-2 群体感应系统的功能研究 |
| 3.1 研究的目的与意义 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要质粒、菌株和细胞 |
| 3.2.3 试验动物 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.2.5 培养基配置 |
| 3.2.6 各类PCR引物 |
| 3.2.6.1 副猪嗜血杆菌luxS基因缺失菌株构建引物 |
| 3.2.6.2 HPS基因缺失互补菌株构建引物 |
| 3.2.6.3 HPS基因缺失菌株和互补菌株验证引物 |
| 3.2.6.4 其他引物 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 luxS基因序列同源性分析 |
| 3.3.2 副猪嗜血杆菌luxS基因缺失和互补菌株的构建及验证 |
| 3.3.2.1 副猪嗜血杆菌基因组提取 |
| 3.3.2.2 质粒小量提取 |
| 3.3.2.3 质粒大量提取 |
| 3.3.2.4 重组质粒p K18mobsacb-UKD的构建及验证 |
| 3.3.2.5 自然转化 |
| 3.3.2.6 重组质粒p SHK3-C-lux S的构建及验证 |
| 3.3.2.7 副猪嗜血杆菌无细胞提取物(CFEs)提取 |
| 3.3.2.8 CFEs体外甲基化质粒 |
| 3.3.2.9 电转化感受态细胞制备 |
| 3.3.2.10 电转化步骤与转化子鉴定 |
| 3.3.3 AI-1和AI-2分子的检测 |
| 3.3.4 HPS2、Δlux S和 C-lux S菌株生长曲线的测定 |
| 3.3.5 压力应激试验 |
| 3.3.6 生物膜形成试验 |
| 3.3.7 自身凝集试验 |
| 3.3.8 红细胞凝集试验 |
| 3.3.8.1 2%健康猪红细胞悬浮液的制备 |
| 3.3.8.2 血凝试验 |
| 3.3.9 粘附试验 |
| 3.3.10 半数致死量试验(LD50) |
| 3.3.11 小鼠组织载菌量的测定 |
| 3.3.12 透射电子显微镜样品准备及形态观察 |
| 3.3.13 统计学分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 luxS基因在不同菌株中的同源性 |
| 3.4.2 副猪嗜血杆菌luxS基因缺失株和互补株的构建及验证 |
| 3.4.3 AI-1和AI-2分子的活性检测 |
| 3.4.4 HPS2、Δlux S和 C-lux S菌株生长曲线的测定 |
| 3.4.5 压力应激试验 |
| 3.4.6 ΔluxS菌株生物膜形成能力显着增强 |
| 3.4.7 ΔluxS菌株自身凝集能力显着减弱 |
| 3.4.8 ΔluxS菌株血凝能力显着减弱 |
| 3.4.9 Δlux S菌株粘附PK-15 细胞的能力减弱 |
| 3.4.10 ΔluxS菌株毒力显着减弱 |
| 3.4.11 HPS2、Δlux S和 C-lux S菌株的组织载菌量 |
| 3.4.12 HPS2、Δlux S和 C-lux S菌株的形态观察 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 LuxS基因序列同源性分析 |
| 3.5.2 luxS基因缺失和互补菌株的构建策略分析 |
| 3.5.3 luxS基因缺失株和互补株的生长特性比较 |
| 3.5.4 Lux S基因参与HPS调控环境应激 |
| 3.5.5 副猪嗜血杆菌群体感应系统AI-2分子的表达规律 |
| 3.5.6 副猪嗜血杆菌luxS基因与生物膜的关系 |
| 3.5.7 群体感应系统与副猪嗜血杆菌毒力 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 副猪嗜血杆菌群体感应系统缺失株转录组学及其抵抗热应激机制研究 |
| 4.1 研究的目的与意义 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 实验数据分析软件 |
| 4.2.4 试验菌株 |
| 4.2.5 PCR引物 |
| 4.2.5.1 定量检测引物 |
| 4.2.5.2 副猪嗜血杆菌rse A和 rpo E基因缺失株构建引物 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 RNA-Seq测序样品的准备 |
| 4.3.2 细菌RNA的提取 |
| 4.3.3 RNA样品中DNA的去除 |
| 4.3.4 反转录cDNA |
| 4.3.5 RNA-Seq测序与分析 |
| 4.3.5.1 总RNA样品检测 |
| 4.3.5.2 文库构建 |
| 4.3.5.3 库检和测序 |
| 4.3.5.4 生物信息分析 |
| 4.3.6 荧光定量PCR |
| 4.3.7 副猪嗜血杆菌rse A和 rpo E基因缺失株的构建及生长曲线的测定 |
| 4.3.8 热应激试验 |
| 4.3.9 统计学分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 RNA样品的质量检测 |
| 4.4.1.1 RNA样品的浓度测定 |
| 4.4.1.2 RNA样品的电泳检测 |
| 4.4.1.3 RNA测序样品的选择 |
| 4.4.2 测序数据质量评估 |
| 4.4.3 参考序列比对分析 |
| 4.4.4 基因表达水平分析 |
| 4.4.5 RNA-Seq样品质量评估 |
| 4.4.6 RNA-Seq差异表达基因 |
| 4.4.7 RNA-Seq差异基因GO富集 |
| 4.4.8 差异基因KEGG富集分析 |
| 4.4.9 差异基因的RT-q PCR验证 |
| 4.4.10 副猪嗜血杆菌rseA基因缺失株和rpoE基因缺失株的构建及验证 |
| 4.4.11 HPS2,Δrse A和 Δrpo E菌株的生长特性 |
| 4.4.12 rse A和 rpo E基因对副猪嗜血杆菌抵抗热应激的影响 |
| 4.4.13 副猪嗜血杆菌热应激相关调节基因的转录水平 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 转录组测序样品的准备 |
| 4.5.2 测序数据的处理和质量评估 |
| 4.5.3 基因表达水平分析 |
| 4.5.4 差异表达基因功能分析 |
| 4.5.5 差异基因富集分析 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 受体蛋白RbsB1在副猪嗜血杆菌群体感应系统中的作用 |
| 5.1 研究的目的与意义 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要质粒菌株 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 主要培养基的配置 |
| 5.2.5 主要PCR引物 |
| 5.2.5.1 HPS2 rbs B1 基因缺失株构建引物 |
| 5.2.5.2 PCR引物 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 rbsB1基因序列的同源性分析 |
| 5.3.2 副猪嗜血杆菌rbsB1基因缺失株的构建、验证及生长曲线的测定 |
| 5.3.3 RbsB1蛋白的表达 |
| 5.3.3.1 重组质粒pet28a-rbs B1 的构建 |
| 5.3.3.2 RbsB1蛋白的诱导表达 |
| 5.3.3.3 RbsB1蛋白的纯化 |
| 5.3.3.4 RbsB1蛋白的检测 |
| 5.3.4 rbsB1基因转录水平的定量检测 |
| 5.3.5 AI-2分子的检测 |
| 5.3.6 统计学分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 rbsB1基因在不同菌株中的同源性 |
| 5.4.2 rbsB1基因在不同菌株中的转录水平 |
| 5.4.3 副猪嗜血杆菌rbsB1基因缺失株的构建及验证 |
| 5.4.4 HPS2和Δrbs B1 菌株生长曲线的测定 |
| 5.4.5 RbsB1蛋白的表达与鉴定 |
| 5.4.6 HPS2和Δrbs B1 菌株培养上清中AI-2 分子的表达水平 |
| 5.4.7 Rbs B1 蛋白与AI-2 分子的相互作用 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 rbsB1基因的同源性分析 |
| 5.5.2 Rbs B1 受体蛋白与群体感应系统AI-2 分子的相互作用 |
| 5.6 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 基本信息 |
| 致谢 |
（7）宏基因组高通量测序对中枢神经系统感染性疾病的诊断价值研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分: 宏基因组高通量测序对病毒性脑(膜)炎的诊断价值研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 宏基因组高通量测序对结核性脑膜炎的诊断价值研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: 宏基因组高通量测序对诊断化脓性脑膜炎的诊断价值研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分: 宏基因组高通量测序对隐球菌性脑膜炎的诊断价值研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述: 隐球菌性脑膜炎的诊断进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（8）社区获得性肺炎分子诊断方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）苏州地区住院儿童百日咳的临床流行病学及其特征的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 苏州地区住院儿童百日咳的临床流行病学 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 苏州地区住院儿童百日咳临床特点分析 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读硕士期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（10）浙江省流感重症肺炎临床特点及甲型H1N1pdm09流感病毒血凝素与神经氨酸酶基因特征分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 流感重症肺炎临床特点分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 临床资料收集 |
| 1.4 临床定义 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 流行概况 |
| 2.2 人口学特征 |
| 2.3 临床表现、实验室及影像学检查 |
| 2.4 临床治疗与转归情况 |
| 2.5 死亡危险因素分析 |
| 2.6 NAI治疗方案分析 |
| 2.7 继发感染分析 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 甲型H1N1pdm09流感病毒血凝素与神经氨酸酶基因特征分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 人口学特征 |
| 2.2 HA基因特征分析 |
| 2.3 NA基因特征分析 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的论文 |
四、流感嗜血杆菌实验室诊断存在的问题与展望（论文参考文献）
- [1]儿童常见呼吸道病原免疫预防专家共识[J]. 国家呼吸医学中心. 中华实用儿科临床杂志, 2021(22)
- [2]副猪嗜血杆菌病研究进展[J]. 张昆丽,李春玲. 广东农业科学, 2020(12)
- [3]2016-2018年北京市流感共感染病原谱研究[D]. 龙朋伟. 军事科学院, 2020(02)
- [4]副猪嗜血杆菌脂多糖刺激猪肺泡巨噬细胞引起NLRP3的变化及其对NF-κB信号通路的影响[D]. 沈文慧. 山东农业大学, 2020(11)
- [5]基于微滴式数字PCR技术的百日咳鲍特菌检测方法的建立、评价与应用[D]. 张恬恬. 山东大学, 2020(02)
- [6]副猪嗜血杆菌LuxS/AI-2群体感应系统研究[D]. 张丙周. 华中农业大学, 2020(02)
- [7]宏基因组高通量测序对中枢神经系统感染性疾病的诊断价值研究[D]. 邢小微. 中国人民解放军医学院, 2019(02)
- [8]社区获得性肺炎分子诊断方法的建立及初步应用[D]. 段芃嫄. 昆明医科大学, 2019(06)
- [9]苏州地区住院儿童百日咳的临床流行病学及其特征的研究[D]. 王琨. 苏州大学, 2019(04)
- [10]浙江省流感重症肺炎临床特点及甲型H1N1pdm09流感病毒血凝素与神经氨酸酶基因特征分析[D]. 邹迁达. 浙江大学, 2019(03)