一、内耳免疫反应中内耳血管细胞粘附分子-1和α_4-整合素的表达（论文文献综述）
叶城[1]（2020）在《草鱼大脑和垂体中神经肽挖掘及速激肽功能鉴定》文中研究指明在脊椎动物中,大脑和垂体是机体内极其重要的器官。大脑可以通过合成与释放神经肽调节垂体激素的合成与分泌,进而参与机体生长、生殖、应激和免疫等生理过程的调控。与哺乳动物不同,鱼类的下丘脑-垂体轴缺失了门脉系统,因此调控垂体激素合成与分泌的上游神经肽变得更为庞大和复杂。基于此,本研究以草鱼（Ctenopharyngodon idellus）为研究对象,首先,通过组织切片技术分析草鱼不同大脑亚区及垂体的形态和显微结构,并结合生物信息学方法初步探究草鱼各脑区和垂体的功能及各脑区间的相互关系。接着,基于草鱼基因组数据库和草鱼大脑各亚区和垂体的转录组数据,挖掘草鱼大脑和垂体中的神经肽编码基因及其相关受体信息,并对它们在草鱼大脑不同亚区和垂体内的分布进行分析。最后,以挖掘出的速激肽家族的神经肽为切入点,分别研究了TAC3编码产物NKB和NKBRP以及TAC4编码产物HK1和HK2在草鱼垂体内的功能及其作用机制。主要研究结果如下:1、草鱼大脑和垂体的形态学和组织学H.E染色切片结果显示,草鱼大脑主要由6个亚区构成,包括嗅球、端脑、视顶盖、下丘脑、小脑和延脑。与软骨鱼类和哺乳类不同,草鱼大脑和垂体间无下丘脑-垂体门脉系统,下丘脑的神经元直接伸入并终止于前腺垂体内。通过分析草鱼不同脑区和垂体的转录组测序数据,本研究发现嗅球可能与生殖和免疫有关;端脑可能参与食欲和生殖的调控;视顶盖不仅在视觉系统中发挥重要功能,并可能涉及摄食行为的调控;下丘脑在摄食和生殖过程中扮演重要角色;延脑与听觉系统有关;垂体在能量代谢、器官发育和生殖过程中起关键作用。相关性分析结果显示,下丘脑和端脑不仅在结构上高度相关,其功能也存在重叠性,表明端脑和下丘脑可能是硬骨鱼类摄食和生殖的调控中心。2、结合草鱼基因组数据库和草鱼大脑各亚区及垂体的转录组数据,本研究系统地挖掘了来自23个家族共计91个神经肽前体编码基因,以及上述神经肽相对应的112个受体基因。基于RNA-seq数据,对上述基因在草鱼6个不同大脑亚区和垂体内的转录本表达水平进行分析。最后,结合已有研究和本研究的结果,对神经肽及其受体在草鱼大脑和垂体的主要合成区域和功能行使位置进行了预测。3、以草鱼垂体细胞为研究对象,转录组分析表明NKB能够诱导垂体内729个基因的差异表达,这些基因涉及了激素活性、食物摄入、信号转导和代谢等。体外细胞培养和RT-q PCR结果显示,NKB在草鱼垂体细胞中可以以时间和剂量依赖的方式诱导四种厌食肽（UTS1、CART、POMCb和NMB）m RNA的表达。受体选择性和受体后信号通路实验结果显示,NKB对草鱼垂体中UTS1、CART、POMCb和NMB表达的刺激作用均能由NK3R介导。这些反应激活了腺苷酸环化酶/蛋白激酶A（c AMP/PKA）通路、磷脂酶C/肌醇1,3,5-三磷酸/蛋白激酶C（PLC/IP3/PKC）通路和Ca2+/钙调蛋白/Ca M-依赖性蛋白激酶II(Ca2+/Ca M/Ca MK-II)通路。此外,腹腔注射NKBa能够显着诱导草鱼垂体内这四种厌食肽m RNA表达。此外,摄食实验结果显示,草鱼进食后下丘脑内的TAC3a和TAC3b m RNA表达显着提高。这些结果表明,NKB是一个饱感因子,它能够通过调节垂体中厌食肽的表达参与硬骨鱼类摄食调节。4、以草鱼为研究对象,本研究从草鱼大脑和垂体中克隆得到TAC4基因及其受体NK1Rb和NK3Ra1。序列分析显示草鱼TAC4能够编码HK1和HK2成熟肽。组织表达分析表明TAC4在下丘脑、嗅球和延脑中高表达,受体NK1Rb、NK3Ra2和NK3Rb等均在垂体中有较高的表达,预示TAC4在草鱼垂体中可能发挥重要功能。通过在HEK293T细胞膜上表达NKRs,HK2对6个NKRs均有较高的激活效率,其中对NK2R应是HK2的特异性受体;而HK1仅能微弱激活NK2R、NK3Ra2和NK3Rb。转录组测序和生物信息学分析结果显示,HK2能够诱导垂体细胞内1051个基因差异表达,这些基因主要涉及食欲的负调节、激素活性、受体配体结合和G蛋白偶联受体信号通路等。在草鱼垂体原代细胞中,HK2能够以时间依赖性和剂量依赖性的方式促进PRL、SLα、UTS1、NMB1、CART2和SN2 m RNA表达,而HK1对上述基因均无显着反应。为了解析HK1在草鱼垂体内的失活原因,本研究将含VFGLM基序的HK1修改为FFGLM基序的HK1突变体（HK1-M）。受体-配体反应表明,不同于HK1,HK1-M对6个NKRs展现了很高的激活效率。同时,HK1-M能够显着诱导草鱼垂体细胞内UTS1、PRL和SLαm RNA表达。此外,HK1和HK2共处理垂体细胞实验显示,HK1不能有效阻断HK2在垂体中的功能,表明HK1不是HK2的内源性拮抗剂。综上结果表明,HK2可以直接作用于草鱼垂体细胞,通过受体NKRs的介导,促进垂体内PRL、SLα、UTS1、CART2、NMB1和SN2的m RNA表达;而HK1因其FXGLM序列突变致使其功能丢失。综上所述,本研究建立了草鱼不同大脑亚区和垂体的解剖学和转录组数据库,对草鱼不同脑区以及垂体的结构和功能做出了初步分析,深入挖掘了草鱼大脑和垂体内的神经肽前体及其受体基因,并以速激肽家族为切入点,研究了TAC3编码产物和TAC4编码产物在垂体中的功能及作用机制。本研究有助于丰富我们对鱼类大脑不同亚区显微结构和功能的认识,为进一步深入研究鱼类神经肽的功能提供了基础。
周秀娟[2]（2019）在《参芪复方的靶点网络构建及改善胰岛微循环障碍的实验研究》文中研究说明目的:基于网络药理学预测参芪复方治疗2型糖尿病的潜在靶点及作用机制;并以糖尿病血糖波动大鼠为研究对象,通过实验研究对参芪复方改善胰岛微循环进行疗效评价与机制探索。方法:1、以参芪复方为研究对象,运用网络药理学的研究方法,首先借助TCMSP数据库筛选参芪复方的化学组分及相关靶点,运用Cytoscape3.6.1对其“组分—靶点”进行网络拓扑学分析,通过Uniprot数据库进行官方名称校正及基因代码转换;其次,借助CTD/TTD/Drug Bank等数据库获取2型糖尿病相关靶点;将“药物—靶点”与“疾病—靶点”进行关联分析,获取参芪复方与2型糖尿病的共同作用靶点。借助STRING 11.0数据库构建其蛋白互作（PPI）网络,通过David数据库进行GO分析及KEGG通路富集分析,预测参芪复方治疗2型糖尿病的潜在靶点及作用机制。2、70只SD大鼠适应性喂养1周,采用链脲佐菌素（STZ）制备糖尿病模型,将糖尿病大鼠随机分为模型组（M）、中药高剂量组（SH）、中药中剂量组（SM）、中药低剂量组（SL）、格华止组（G）;此后连续8周每周2天定时予以皮下注射超短效胰岛素3U及腹腔注射250g/L葡萄糖溶液0.38g/（kg·d）,制备糖尿病血糖波动模型;另设10只普通SD大鼠作为空白对照组（C）。各组大鼠进行血糖波动造模的同时给予相应药物干预。药物干预期间每日观察大鼠一般状态（体质量、摄食量、饮水量）,每周测试1日5点血糖水平,计算各项血糖波动指数（MBG、SDBG、LABG）;药物干预8周后处死大鼠,腹主动脉采血,ELISA法检测血清胰岛素、肾素、血管紧张素II（Ang II）、醛固酮（ALD）;采集胰腺组织,HE染色观察胰岛病理形态改变、检测胰岛微血管数量与密度、胰岛微血管管壁厚度,免疫组织化学法（IHC）检测胰岛α细胞、β细胞数量;TUNEL法检测胰岛细胞凋亡情况;高通量测序法对胰岛微血管进行Affymetrix WT表达谱芯片测序,借助David数据库对差异基因进行GO分析及KEGG通路富集分析;QPCR技术检测胰岛ACE2、IRS-1、AKT1 m RNA表达水平;Western blot技术检测胰岛ACE2、Mas1、IRS-1、pan-AKT蛋白表达水平。结果:1、网络药理学研究结果（1）参芪复方药物配伍后,共计获得152个活性化合物组分,对应278个靶标蛋白;T2DM“疾病-靶点”共计26924个;将“药物—靶点”及“疾病—靶点”进行关联分析后,获得方剂与疾病共同作用靶点共计261个,其中一氧化氮合酶（NOS）家族、蛋白激酶B（AKT）家族是其核心靶点群,与代谢、炎症相关通路等密切相关。（2）“药物—疾病”共同靶点经KEGG通路富集分析,获得参芪复方治疗T2DM的通路共计182条;经文献比对,其中52条通路与T2DM密切相关,包括氧化应激（AGE-RAGE信号通路）、炎症反应（IL-17信号通路、TNF信号通路）、细胞凋亡、胰岛素抵抗等多条信号通路。（3）将上述靶点及通路与文献信息比对,预测参与胰岛微循环的靶标蛋白约35个,包括蛋白激酶B（AKT）家族、基质金属蛋白酶（MMP）家族、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族、肾素血管紧张素系统（ACE2、ANG2、ACE）等。2、实验研究结果（1）一般情况及胰岛病理结果显示:治疗后,中药三组大鼠整体情况较佳,毛色光亮,精神状态良好。M组与G组大鼠在造模后体质量不断下降,但中药三组（SH、SM、SL）大鼠体质量呈先降后升的趋势,与M组及G组比较具有明显差异（p<0.01,p<0.05）;造模后各组大鼠摄食量及饮水量均明显增加,与M组比较,中药三组（SH、SM、SL）可在一定程度上减少糖尿病多食、多饮情况（p<0.01）。各组大鼠胰岛病理损伤严重程度依次为:M>SH>G>SM>SL>C。（2）胰岛内分泌细胞及糖调节激素结果显示:与C组比较,造模后各组大鼠胰岛α细胞无明显变化（p>0.05）,而β细胞明显减少（p<0.01）;治疗后,与M组比较,SL组胰岛β细胞增加（p<0.05）;与M组比较,中药三组（SH、SM、SL）均可在一定程度上改善胰岛细胞凋亡（p<0.01,p<0.05）;与M组比较,SH组可在一定程度上恢复胰岛素水平（p<0.05）。（3）胰岛微循环各组分结构显示:治疗后,与M组比较,中药三组（SH组、SM组、SL组）大鼠胰岛微血管管壁增厚情况明显改善（p<0.01）;与M组比较,SM组胰岛微血管数量增加（p<0.05）,SL组、SM组胰岛微血管密度增加（p<0.05）。（4）肾素血管紧张素系统（RAS）激素结果显示:造模后各组大鼠血清肾素（Renin）均明显降低（p>0.05）,治疗后未见明显变化（p>0.05）;治疗后,与M组比较,中药三组（SH、SM、SL）血管紧张素II（Ang II）显着降低（p<0.01）;治疗后,与M组、G组比较,SL组大鼠血清醛固酮水平降低（p<0.05）。（5）胰岛微血管Affymetrix WT表达谱芯片测序及生物信息学分析显示:组间存在基因的显着差异表达:（1）模型组（M）与空白组（C）比较,获得差异基因共183个,其中上调基因59个（32.24%）,下调基因124个（67.76%）;GO富集获得99个条目,其中生物学过程44条（44.4%）,主要涉及胰岛素分泌参与细胞对葡萄糖刺激的反应、G蛋白偶联受体信号通路等;KEGG信号通路富集分析结果共16条,包括淀粉和蔗糖的代谢,肾素-血管紧张素系统,碳水化合物的消化和吸收,代谢途径等。（2）中药组（SL）与模型组（M）比较,差异基因共321个,其中上调基因239个（74.45%）,下调基因82个（25.55%）;GO富集获得93个条目,其中生物学过程59条（63.4%）,主要涉及G蛋白偶联受体信号通路、血管生成、血管形态发生等;KEGG信号通路富集分析结果共9条,包括核糖体,代谢途径等。（3）格华止组（G）与模型组（M）比较,差异基因共301个,其中上调基因183个（60.80%）,下调基因118个（39.20%）;GO富集获得74个条目,其中生物学过程50条（67.6%）,主要涉及钙调节通路等;KEGG信号通路富集分析结果共15条,包括Wnt信号通路,m TOR信号通路,Hippo信号通路等。（6）胰岛微循环关键调控靶点蛋白及m RNA表达情况显示:治疗后,与M组比较,中药组（SL组）ACE2、IRS-1 m RNA表达水平升高（p<0.01,p<0.05）,AKT1 m RNA表达水平有升高趋势,但无统计学意义（p>0.05）;中药组（SH组、SL组）ACE2、Mas1、IRS-1、pan-AKT蛋白表达水平增高（p<0.01,p<0.05）。结论:1、参芪复方具有“多组分、多靶点、多途径”的作用特点,可通过调节多个靶标蛋白及信号通路起到防治2型糖尿病的作用。2、参芪复方具有改善糖尿病血糖波动大鼠胰岛微循环的功效。参芪复方可在一定程度上改善糖尿病血糖波动大鼠多饮、多食、体重减轻等症状及胰岛病理形态,并且改善胰岛细胞凋亡,恢复糖调节激素水平,降低RAS激素的血管损伤,改善胰岛微血管血供,从而改善胰岛微循环。3、2型糖尿病胰岛微循环障碍具有多基因、多途径的特点,肾素-血管紧张素系统可能是参与胰岛微循环的重要环节,参芪复方改善糖尿病血糖波动大鼠胰岛微循环的可能机制是通过激活RAS旁路途径（ACE2/Mas轴）,促进IRS-1及AKT表达而实现。
唐朝颖[3]（2019）在《噪声引起的耳蜗血管纹微血管损伤及蛋白质组学变化》文中研究指明噪声性耳聋是一种常见的感音性耳聋,其发病原因除了噪声导致的机械损伤,还引起了包括代谢损伤在内的一系列器官、细胞及分子水平的病理变化。血管纹位于耳蜗外侧壁的螺旋韧带内侧,血管纹微血管是血-迷路屏障（blood-labyrinth barrier,BLB）的主要构成部分,BLB是位于血管纹中间层的一层特殊分化的毛细血管网,通过紧密连接和膜屏障调控耳蜗内微环境,对维持耳蜗内电位稳定至关重要。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）,具有高度生物活性的血管通透因子,噪声暴露后VEGF在血管纹的表达明显增高,影响血管纹微血管通透性,此外,血管纹微血管内皮细胞间的黏附连接在调节微血管通透性方面也起着重要作用,并且连接蛋白的表达及功能受VEGF调控。在VEGF对钙黏连蛋白（VE-cadherin）的调节过程中,酪氨酸激酶（Src kinase）起到至关重要的作用。血管纹损伤引起的微血管通透性增高、血迷路屏障破坏,是导致噪声性聋的原因之一。但噪声对血管纹微血管的损伤机制仍不明确,VEGF如何调控微血管通透性仍需要深入研究。同位素标记的相对和绝对定量法（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）技术是一种利用同位素标记蛋白质和多肽的技术。结合液相色谱分离联合质谱鉴定技术,可以标记生物蛋白样品中的几乎所有肽段。iTRAQ技术能够发现非生理状态下的疾病特异性蛋白,有利于阐明疾病发病机理以及疾病的预防、诊断、治疗及预后监测。iTRAQ等体外标记定量技术可以高效的应用于差异蛋白的筛选,但最终筛选的蛋白质是否有意义,需要进行后期验证。平行反应监测（parallel reaction monitoring,PRM）是靶向蛋白质组学的一种技术,应用于检测目标蛋白质,是目前最灵敏的质谱检测技术,作为蛋白质谱分析的“金标准”,被越来越多的应用于差异蛋白后续验证,具有高通量、特异性和高灵敏度等优点。蛋白质组学技术的发展,有助于我们明确噪声损伤后耳蜗血管纹的蛋白质水平变化,为噪声性聋的防治提供新方向。第一部分:为研究噪声对耳蜗血管纹微血管的损伤,及VEGF对微血管通透性的调控机制,本部分实验应用噪声性聋小鼠模型,采用免疫荧光法、免疫印迹实验和激光共聚焦显微镜成像扫描技术观察噪声暴露后耳蜗血管纹VEGF、Src的表达变化及微血管通透性的改变。通过腹腔注射血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）抑制剂SU5416和Src抑制剂PP1,比较噪声暴露后血管纹微血管内皮细胞间VE-cadherin表达量的变化,通过尾静脉注射Evansblue,观察微血管通透性的改变。发现:噪声暴露后小鼠耳蜗血管纹血管内皮细胞中VEGF和边缘细胞中Src表达量增多,而内皮细胞间VE-cadherin表达量降低,微血管通透性增高;应用VEGFR2抑制剂SU5416后,SU5416组Src表达量较NE组显着降低,而VE-cadherin表达量较NE组显着增多;应用Src抑制剂PP1后,PP1组VE-cadherin表达量较NE组显着增多,且血管纹微血管通透性较NE组降低。提示噪声引起的血管纹微血管通透性增高受VEGF调控,VEGF通过与VEGFR2结合后激活Src来调控内皮细胞间黏附连接蛋白VE-cadherin的表达,是噪声暴露后血-迷路屏障通透性增加的重要原因。第二部分:为探讨噪声损伤后耳蜗血管纹的蛋白质水平变化,本部分实验进行了耳蜗血管纹蛋白质组学研究。应用iTRAQ技术对噪声暴露前后小鼠耳蜗血管纹的差异蛋白进行筛选,并应用生物信息学分析对差异蛋白进行GO（Gene Ontology）分析和 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析。结果显示:iTRAQ 技术共鉴定到2852个蛋白,噪声暴露后表达差异蛋白171个,其中上调56个,下调115个。上调蛋白中,表达量较高的蛋白包括角蛋白Ⅱ型细胞骨架8（Krt8）、波形蛋白（Vim）、角蛋白Ⅰ型细胞骨架18（Krt18）、角蛋白Ⅱ型细胞骨架7（Krt7）;下调蛋白中,表达量较高的蛋白包括Kcnj10蛋白（Kcnj10）、缝隙连接蛋白beta-2（Gjb2）、神经细胞黏附分子1（Ncam1）、谷氨酰氨合成酶（Glul）、缝隙连接蛋白beta-6（Gjb6）、载脂蛋白D（Apod）,表达差异倍数大于1.5倍的蛋白包括Kcnj10蛋白（Kcnj10）、泛素羧基末端水解酶14（Usp14）、神经细胞黏附分子1（Ncam1）、缝隙连接蛋白beta-6（Gjb6）,其中与K+转运相关的蛋白包括:Kcnj10蛋白（Kcnj10）、内向整流钾通道13（Kcnj13）、溶质载体家族12（Slc12a9）;GO分析显示上调蛋白主要参与免疫反应、氧化磷酸化,提示噪声导致血管纹细胞代谢反应增高,下调蛋白主要是离子转运相关蛋白,与噪声破坏血管纹的K+循环相关;KEGG分析差异蛋白显着富集的通路包括脂类分解、朊病毒病、MAPK信号通路、EB病毒感染、氮代谢信号通路,这些信号通路在炎症、免疫反应和细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用,可能参与了噪声导致的血管纹损伤机制。第三部分:为了进一步明确噪声损伤后耳蜗血管纹蛋白质组学差异蛋白的意义,本部分实验应用PRM技术对第二部分中iTRAQ筛选出的差异蛋白进行定量验证,运用生物信息学方法分析噪声对耳蜗血管纹损伤的机制。结果显示:经PRM验证与iTRAQ定量结果一致的9个蛋白中,上调蛋白包括富含组氨酸糖蛋白（Hrg）、cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基（Prkaca）、角蛋白,Ⅰ型细胞骨架18（Krt18）、四次跨膜蛋白（Cd63）和细胞粘附分子4（Cadm4）;下调蛋白包括载脂蛋白D（Apod）、肌醇质子转运蛋白（Slc2a13）、Kcnj10蛋白（Kcnj10）和Myo1b蛋白（Myo1b）。GO分析其生物过程主要涉及细胞黏附连接、细胞凋亡、蛋白磷酸化、氧化应激、炎症因子反应及K+转运,提示噪声对血管纹的损伤涉及细胞间连接损伤、K+循环破坏及多种复杂代谢机制。蛋白互作分析发现差异蛋白主要涉及VEGF-VEGFR2信号通路、黏着斑信号通路和MAPK信号通路。综上,噪声暴露对耳蜗血管纹蛋白质水平的影响,主要表现为免疫反应和氧化磷酸化等代谢反应增高,对钾离子和微循环平衡的调节有重要作用的离子转运相关蛋白和钾离子通道下调。噪声介导的K+循环障碍、连接蛋白破坏、细胞凋亡、氧化应激反应及蛋白磷酸化是造成血管纹损伤的主要机制。VEGF-VEGFR2信号通路是噪声暴露后耳蜗血管纹微血管通透性改变的重要机制,VEGF通过与VEGFR2结合后激活Src来调控内皮细胞间黏附连接蛋白VE-cadherin的表达,黏着斑信号通路和MAPK信号通路在噪声对血管纹的损伤中也起到重要作用。
王淞[4]（2019）在《P311在创面血管新生中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景皮肤创面是临床最常见病症之一,烧伤、创伤、手术及多种内科疾病等均可导致皮肤创面的发生。创面修复,尤其是难愈性创面的修复在临床上仍面临着许多挑战,仅在美国,每年应用于难愈性创面治疗的直接医疗费用就超过了250亿美元。近年来虽对皮肤创面修复进行了较多的研究,但其机理并未完全清楚。创面血管新生是创面修复的关键环节之一,创面血管新生主要包括血管基底膜降解、血管内皮细胞迁移与出芽生长、管腔形成、局部需要性调整与稳定成熟等步骤。整个过程涉及多种细胞与细胞因子,其中微血管内皮细胞是参与此过程的主要功能细胞,它们在多种细胞因子及信号通路的精确调控下,通过迁移、增殖、芽生等而形成新生血管。VEGF（现在表示为VEGFA）是创面愈合过程中最主要的促血管生成因子。VEGF及其介导的各级联信号通路参与血管新生各个过程。VEGFR2是VEGF最主要的结合受体,能够转导VEGF的所有已知作用,是在血管生成中发挥重要作用的VEGFR。VEGF与VEGFR2结合,在小鼠中使得VEGFR2 Tyr1173磷酸化（人类中Tyr1175磷酸化）,该位点的磷酸化对ERK1/2激活至关重要,研究发现将其突变为苯丙氨酸（Tyr1173F）后,在胚胎发育时期内皮祖细胞分化受到抑制,进而导致胚胎早期死亡,这与敲除VEGFR2基因后的表现一致。P311是一种在种属间高度保守的细胞内多功能蛋白。虽然目前P311并不属于任何已知的蛋白质家族,但是现有研究发现P311蛋白在组织纤维化、神经系统疾病、肿瘤浸润、血压维持、组织再生等多方面发挥重要作用。我们课题组近期研究发现,P311在创面愈合中发挥重要作用。P311通过增强表皮干细胞Rho A和Rac1的活性提高表皮干细胞迁移能力,从而促进创面再上皮化。此外,P311可以通过TGFβ1/Smad信号通路,促进表皮干细胞向肌成纤维纤维样细胞转分化,从而促进烧伤创面的修复。鉴于创面血管新生是创面修复的关键环节之一,本课题在通过生物信息学预测发现P311可能参与血管形成的基础上,研究了P311对真皮微血管内皮细胞生物学功能的影响及其在创面血管新生的作用,并进一步从对VEGFR2/Erk1/2信号通路活化和VEGF表达调控的角度探讨了P311调控创面血管新生的分子机制。第一部分构建P311蛋白质相互作用网络初步探索其生物学功能方法:1.生物信息学预测P311功能将前期通过酵母双杂交实验鉴定出的能够与P311相互作用的蛋白,与P311一起构成原始P311蛋白质相互作用网络,进一步将此网络与已知的人类蛋白质相互作用网络分别合并,形成新的蛋白相互作用数据集。通过OCG算法处理该数据集,得到重构的P311蛋白质相互作用网络。通过DAVID分析各组重构P311蛋白质相互作用网络中的蛋白参与的生物过程,以预测P311可能的功能。2.P311在创面愈合过程中炎症反应中的作用使用P311野生型小鼠和P311基因敲除小鼠分别构建全层皮损模型,通过HE染色观察创面浸润炎症细胞;实时定量PCR检测创面CD14和CD16 mRNA水平;流式细胞仪检测创面中F4/80阳性炎症细胞的百分比。3.P311对小鼠成纤维细胞的增殖的影响使用P311重组腺病毒载体转染小鼠成纤维细胞,使之高表达P311。通过CCK8检测P311对成纤维细胞增殖能力的影响;通过流式细胞仪检测P311对细胞周期的影响。4.P311对烧伤后凝血功能的影响使用P311野生型小鼠和P311基因敲除小鼠分别构建浅Ⅱ°烧伤模型,使用血栓弹性描记图监测烧伤后血液的凝血特征。结果:1.生物信息学预测P311功能P311可能拥有14种新功能,其中P311在血管形成、炎症反应、细胞增殖和凝血中发挥作用最可信。2.P311在创面愈合过程中炎症反应中的作用HE染色发现,P311基因敲除小鼠创面炎症细胞和F4/80阳性细胞的数目明显低于P311野生型小鼠。P311基因敲除小鼠创面内CD14和CD16 mRNA水平明显低于P311野生型小鼠。3.P311对小鼠成纤维细胞的增殖的影响P311促进小鼠成纤维细胞的增殖。高表达P311的成纤维细胞中处于S期细胞比例明显较对照组比例高（25.16±4.92%vs 36.68±3.56%,p<0.05）。4.P311对烧伤后凝血功能的影响比较P311 WT烧伤小鼠与P311 KO烧伤小鼠血液血栓弹性描记图,除血凝块形成时间（R 8.850±1.541vs 7.733±1.210min,p=0.57）外,角度、MA和G等参数均有显着差异（p<0.05）。综上所述,我们通过构建P311蛋白质相互作用网络的生物信息学方法,预测了P311可能拥有14种新功能,其中P311在血管形成、炎症反应、细胞增殖和凝血中发挥作用最可信。并通过生物学实验初步证实P311参与炎症反应、细胞增殖和凝血过程。P311在血管形成中的作用在第二三部分进行系统研究。第二部分P311在创面血管新生中的作用方法:1.真皮微血管内皮细胞表达P311,在炎症刺激条件下其表达增强免疫组化和免疫荧光染色观察人创面和小鼠创面P311的表达情况;采用Percoll分离+CD31磁珠分离法分离培养小鼠真皮微血管内皮细胞,荧光和流式检测了分离细胞血管内皮细胞标志物的表达。免疫荧光染色和实时定量PCR检测分离培养的微血管内皮细胞在稳定状态和炎症刺激状态（IL-1β刺激）下P311的表达情况。2.P311对真皮微血管内皮细胞细胞生物学功能的影响利用细胞体外划痕迁移模型检测了P311敲除后对真皮微血管内皮细胞迁移功能的影响;利用体外基质胶血管管腔形成实验检测P311敲除后对真皮微血管内皮细胞体外血管形成的影响;利用体内皮下基质胶栓实验检测P311敲除后对真皮微血管内皮细胞体内血管形成的影响。3.P311在小鼠创面血管新生的作用使用P311野生型小鼠和P311基因敲除小鼠分别构建全层皮损模型,大体和HE染色观察P311野生型小鼠和P311基因敲除小鼠的创面愈合、再上皮化和新生肉芽及微血管形成的规律;免疫组化染色观察小鼠创面、正常皮肤中CD31、VEGF和TGFβ1的表达情况;Western Blot检测小鼠创面、正常皮肤中CD31、VEGF和TGFβ1的表达情况;ELISA检测小鼠创面、正常皮肤中VEGF和TGFβ1的表达情况。结果:1.真皮微血管内皮细胞表达P311,在炎症刺激条件下其表达增强1.1创面微血管内皮细胞表达P311免疫组化观察到在人皮肤创面血管样结构中出现一些P311阳性细胞,进一步通过免疫荧光在小鼠创面中观察到在肉芽组织中vWF阳性细胞也表达P311,即血管内皮细胞表达P311。1.2成功分离培养真皮微血管内皮细胞分离培养的细胞融合后呈特征性“鹅卵石”形态,并且高表达vWF、CD31和CD34。1.3真皮微血管内皮细胞表达P311免疫荧光结果显示小鼠真皮微血管内皮细胞表达P311,但表达量不高,10ng/ml IL1β刺激后表达明显增强。定量PCR结果显示,10ng/ml IL1β刺激后小鼠真皮微血管内皮细胞中P311转录水平明显提高（p<0.01）。2.P311敲除对真皮微血管内皮细胞细胞生物学功能的影响2.1 P311敲除减弱真皮微血管内皮细胞体外血管管腔形成能力体外基质胶血管管腔形成实验结果显示,P311敲除后真皮微血管内皮细胞形成的管状结构中的节点数明显减少（p<0.01）,管状结构总长度明显变短（p<0.01）。2.2 P311敲除减弱真皮微血管内皮细胞体外迁移能力细胞体外划痕迁移实验结果显示,P311敲除后,各观察时间点真皮微血管内皮细胞覆盖区域均明显减少（p<0.01）。2.3 P311敲除减弱真皮微血管内皮细胞体内血管形成能力体内皮下基质胶栓实验结果显示,P311敲除后基质胶栓中内皮细胞数量明显减少p<0.01)。3.P311在小鼠创面血管新生的作用3.1 P311敲除小鼠创面愈合、再上皮化减慢大体观察发现伤后第3天、第5天和第7天P311WT小鼠创面面积百分比均明显小于P311KO小鼠创面面积百分比。P311 WT小鼠创面平均6.2天愈合而P311 KO小鼠的创面平均7.8天愈合（p<0.05）。HE染色发现,伤后第3天和第5天,P311KO小鼠创面新生上皮长度显着短于P311WT小鼠创面新生上皮长度（p<0.05）。3.2 P311敲除小鼠创面新生肉芽及微血管减少HE染色发现,P311KO小鼠创面新生肉芽组织厚度较P311WT小鼠创面新生肉芽组织厚度薄,且P311KO小鼠创面新生肉芽组织中可见的微血管数量较P311WT小鼠创面新生肉芽组织中可见的微血管数量少（p<0.05）。免疫组化染色发现,P311 KO创面小鼠创面新血管数量（CD31阳性细胞）显着低于P311 WT创面小鼠;Western Blot分析结果显示P311WT小鼠创面组织中CD31蛋白水平明显较P311KO小鼠创面CD31蛋白水平高（P<0.01）。3.3 P311敲除小鼠创面VEGF和TGFβ1的表达减少免疫组化染色发现P311 KO创面小鼠创面VEGF和TGFβ1表达均明显低于P311WT创面小鼠;Western Blot结果显示P311WT小鼠创面组织中VEGF和TGFβ1蛋白水平均明显较P311KO小鼠创面VEGF和TGFβ1蛋白水平高（P<0.01）;ELISA结果显示P311 KO创面组织匀浆上清液中VEGF和TGFβ1的浓度明显低于P311 WT创面。综上所述,我们首次报道了P311通过影响真皮微血管内皮细胞的生物学功能来影响创面愈合中的血管新生。第三部分P311促进创面血管新生的机制研究方法:1.P311高表达对真皮微血管内皮细胞细胞生物学功能的影响利用细胞体外划痕迁移模型检测P311高表达对真皮微血管内皮细胞迁移功能的影响;利用体外基质胶血管管腔形成实验检测P311高表达对真皮微血管内皮细胞体外血管形成的影响;nCounter基因表达谱分析系统和实时定量PCR检测P311高表达对真皮微血管内皮细胞血管生成基因表达的影响。2.P311通过VEGFR2/ERK1/2信号通路促进血管形成利用Western blot检测P311高表达对VEGFR2和ERK1/2蛋白表达和磷酸化水平的影响;使用siRNA-VEGFR2和ERK1/2抑制剂SCH772984,利用Western blot和体外基质胶血管形成实验,检测P311通过激活VEGFR2进而激活Erk1/2,从而促进血管形成。3.P311对VEGF表达的调控使用P311重组腺病毒载体转染真皮微血管内皮细胞,使之高表达P311,通过Western Blot和实时定量PCR检测VEGF在微血管内皮细胞内的表达情况,通过ELISA检测VEGF在微血管内皮细胞培养上清中的水平。4.P311调控VEGF表达的分子机制构建VEGF启动子双荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告实验检测P311对VEGF启动子活性的影响;通过亚硫酸氢盐测序法检测P311对VEGF启动子CpG岛甲基化的影响;通过放线菌素D处理符合实时定量PCR检测P311对VEGF mRNA稳定性的影响;构建VEGF非翻译区（Untranslated region,UTR）双荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告实验检测P311对VEGF UTR活性的影响。结果:1.P311高表达对真皮微血管内皮细胞细胞生物学功能的影响1.1 P311高表达提高真皮微血管内皮细胞体外血管管腔形成能力体外基质胶血管管腔形成实验结果显示,P311高表达后真皮微血管内皮细胞形成的管状结构中的节点数明显增多（p<0.01）,管状结构总长度明显变长（p<0.01）。1.2 P311高表达提高真皮微血管内皮细胞体外迁移能力体外细胞划痕迁移实验结果显示,P311高表达后,各观察时间点真皮微血管内皮细胞覆盖区域均明显增多（p<0.01）。1.3 P311高表达上调真皮微血管内皮细胞促血管生成基因的表达实时定量PCR结果显示,真皮微血管内皮细胞高表达P311后,CCL2表达上调3.66倍（p<0.05）,CXCL8表达上调4.58（p<0.05）,FGFR3表达上调2.36（p<0.05）,IL6表达上调2.55（p<0.05）,PTGS1表达上调29.58（p<0.05）,VEGF表达上调2.94（p<0.05）。2.P311通过VEGFR2/ERK1/2信号通路促进血管形成2.1 P311高表达促进VEGFR2和ERK1/2磷酸化P311高表达后,真皮微血管内皮细胞VEGFR2和ERK1/2磷酸化水平分别提高到对照组水平的3.62倍和2.17倍。2.2 siRNA-VEGFR2抑制VEGFR2和ERK1/2磷酸化水平,阻断P311对血管形成的促进作用使用siRNA-VEGFR2后,微血管内皮细胞VEGFR2的磷酸化水平和总蛋白表达明显降低（p<0.05）,Erk1/2的磷酸化水平明显降低（p<0.05）,P311对血管形成的促进作用明显受到抑制（p<0.05）。2.3 SCH772984抑制Erk1/2的磷酸化,阻断P311对血管形成的促进作用使用SCH772984后,微血管内皮细胞Erk1/2的磷酸化水平明显降低（p<0.05）,P311对血管形成的促进作用明显受到抑制（p<0.05）。3.P311对VEGF表达的调控实时定量PCR结果显示,P311高表达后,微血管内皮细胞内VEGF mRNA水平显着升高（p<0.05）;Western Blot结果显示,P311高表达后,微血管内皮细胞内VEGF蛋白质水平显着升高（p<0.01）;ELISA结果显示,P311高表达后,微血管内皮细胞培养上清中VEGF含量显着升高（p<0.01）。4.P311调控VEGF表达的分子机制4.1 P311可能通过与VEGF启动子-2000到-1550区域结合,从而提高启动子活性,促进VEGF的转录双荧光素酶报告实验结果显示,P311可能通过与VEGF启动子-2000到-1550区域结合。亚硫酸氢盐测序结果显示P311对VEGF启动子CpG岛甲基化无影响。4.2 P311通过与VEGF mRNA 3’-UTR和5’-UTR结合并提高其活性,进而诱导VEGF蛋白的翻译实时定量PCR结果显示,P311高表达对VEGF mRNA的稳定性没有影响;双荧光素酶报告实验结果显示,P311与VEGF mRNA 3’-UTR和5’-UTR结合并提高其活性,进而诱导VEGF蛋白的翻译综上所述,P311可能通过与VEGF启动子-2000到-1550区域结合,从而提高启动子活性,进而促进VEGF的转录,同时P311通过与VEGF mRNA 5’-UTR和3’-UTR结合并提高其活性,促进VEGF翻译,从而促进VEGF的表达和分泌,进而激活VEGFR2/Erk1/2通路,促进血管新生。结论本研究首次证明P311是一种新的促进创面血管新生的关键分子,P311可能通过与VEGF启动子-2000到-1550区域结合,提高启动子活性,促进VEGF的转录;P311通过与VEGF mRNA 5’-UTR和3’-UTR结合并提高其活性,促进VEGF的翻译,从而促进VEGF的表达和分泌,进而激活VEGFR2/Erk1/2信号通路促进血管形成。
牛茜楠[5]（2018）在《机械牵张应力下Cofilin调节NF-κB对成骨细胞成骨效应影响的分子机制研究》文中研究指明力学刺激在骨代谢中发挥着举足轻重的调节作用。在人体骨骼结构及人类日常生活中,生物力学刺激对骨组织的新陈代谢起着非常重要的作用。骨量的维持依赖于机械力学刺激,同时骨量又对机械力学刺激发生适应性改建。适宜的牵张应力可以在牵张成骨、骨折修复、正畸牙齿移动等许多临床治疗中刺激骨组织自身的生长与重建,达到促进新骨形成的目的,重复增加的负荷,如定期规律地运动,也可以诱导新的骨形成,而缺乏力学刺激如长期卧床、神经肌肉麻痹或航天飞行等情况下力学负荷减少,承重骨骼中的骨质量就会丧失。在过去的几十年里,骨细胞逐渐被大家公认为是骨骼内的应力感受细胞和效应细胞,骨细胞通过将外部机械力转化为生物化学反应来协调重塑过程,这是一种称为机械转导的过程。探索成骨细胞的生物力学信号转导机制对于阐明骨改建的机理,发现调控骨生长的新靶点具有重要意义。NF-κB是参与骨代谢,调节炎症,影响先天性和适应性免疫反应的最重要的转录因子之一1,2。在骨骼形成方面,NF-κB信号直接参与破骨细胞的分化和活化3,4。慢性NF-κB激活沿着成骨途径影响间充质干细胞（mesenchym al stem cell,MSC）分化,削弱成骨细胞介导的骨形成5。众多学者的研究提示NF-κB参与机械应力刺激下细胞内的反应过程。而NF-κB的激活即RelA/p65（NF-κB亚基）向细胞核的易位需要肌动蛋白细胞骨架的动态改变;干扰肌动蛋白细胞骨架的改变会抑制RelA/p65的核聚集7。因此,肌动蛋白细胞骨架重塑可能会影响NF-κB活性并参与一系列反应。在本课题组的前期工作中对机械牵张应力加载前后的成骨细胞进行了蛋白质组学分析,其中细胞骨架调节蛋白--丝切蛋白Cofilin的表达在加载后显着增高,并明确了Cofilin在机械应力刺激中对成骨分化的积极作用6。Cofilin是一种肌动蛋白结合蛋白,通过刺激肌动蛋白丝的切断和去聚合作用,在肌动蛋白丝动力学和重组过程中发挥重要作用8,Cofilin作为影响调控细胞骨架蛋白的重要因子也同样是力学敏感蛋白,综上考虑,本研究推测成骨细胞内,Cofilin对NF-κB同样有调控作用,并设计了两部分研究内容:第一部分机械牵张应力作用下NF-κB对成骨细胞成骨效能的影响目的:探索机械牵张应力作用下,NF-κB对成骨细胞成骨效能的影响;方法:应用慢病毒转染的方法分别建立成骨细胞MG63内RelA（NF-κB的主要亚基）过表达与下调的模型,随后应用Flexcell细胞力学加载系统对不同RelA表达情况的成骨细胞MG63加载12%的静态牵张力,并设置1h、4h、8h、12h不同加力时长,同时设置不加力对照组,加力完成后收集细胞,使用酶动力学法检测不同分组细胞碱性磷酸酶表达情况,茜素红染色检测钙结节形成,Elisa法检测骨钙素与I型胶原分泌并使用实时定量RT-PCR的方法检测成骨相关重要基因Runx-2、Osterix和I型胶原的表达;结果:RelA过表达的MG63组细胞在加载机械牵张应力后,不同加力时长成骨细胞内成骨相关蛋白及基因表达有所不同,随着加力时间的延长,成骨相关ALP,骨钙素以及I型胶原的表达均出现了小幅增长,随后下降的趋势;相比于MG63组细胞,RelA过表达组的三种成骨相关蛋白增长趋势较弱,同时需要较长时间的牵张力刺激,钙结节的表达情况也明显低于MG63组。RT-PCR检测了Runx-2、Osterix和I型胶原的基因表达情况,结果与蛋白表达相关实验结果呈现相类似的变化趋势。而RelA下调MG63组的细胞,成骨相关蛋白表达显着高于正常细胞组,成骨相关基因的表达也远高于正常细胞组,同时只需要相对较短的加力时长,加力仅1h就出现成骨相关蛋白与基因表达的显着增高;结论:机械牵张应力刺激下,成骨细胞的成骨性能发生显着变化;不同时长的12%静态牵张力对成骨细胞成骨性能影响不同。NF-κB在机械牵张应力刺激下对成骨细胞的成骨性能发挥着显着的负向调控作用。本研究深入研究了机械牵张应力作用下成骨细胞内NF-κB的作用,为理解机械力学刺激下成骨细胞内的作用机制提供了一定的理论基础。第二部分机械牵张应力作用下成骨细胞内Cofilin对NF-κB的调控机制研究目的:系统探讨机械牵张应力作用下成骨细胞内Cofilin的表达和NF-κB活性之间的关系,以明确机械牵张应力能否通过上调Cofilin表达进而抑制NF-κB活性从而促进成骨;方法:应用慢病毒转染的方法分别上调和下调成骨细胞MG63内Cofilin的表达,对细胞加载12%的静态牵张力,并设置15min、30min、45min、60min不同加力时长,同时设置不加力对照组,加力完成后收集细胞,应用Western Blotting分别检测细胞全蛋白内NF-κB激活相关重要蛋白IκBα,p-IκBα,IKK和p-p65的表达和细胞核蛋白内p-p65的表达,并通过双荧光素酶报告基因的方法验证NF-κB与启动子DNA结合的能力变化,以及Cofilin对NF-κB的调节作用;结果:细胞全蛋白WB的结果显示相比于Cofilin过表达MG63组与MG63组,Cofilin下调MG63组NF-κB的抑制蛋白IκBα降低较快且更明显,同时p-p65也很快在细胞中聚集,并通过核蛋白WB的结果看到p-p65明显发生核内聚集移位,表明Cofilin下调MG63组NF-κB的激活较快发生,并且能在不同时长的加力中仍保持激活状态;双荧光素酶报告基因结果证实了Cofilin下调MG63组NF-κB与启动子DNA的结合能力较强,并需要较短时间的机械力刺激就可显着提高其活力;结论:机械牵张应力作用下,成骨细胞内NF-κB活性发生显着变化,适当时长的机械牵张应力可以有效激活NF-κB,其中加力30min时成骨细胞内NF-κB活性最高,与启动子DNA结合能力最强;机械牵张力作用下,Cofilin对NF-κB发挥着显着的负向调控作用,机械牵张应力可以通过上调Cofilin的表达抑制NF-κB的活性,继而促进成骨细胞成骨分化,证实了Cofilin可以通过抑制NF-κB的表达来促进成骨细胞的成骨性能。
张志伟[6]（2015）在《基于生物组学的羟基磷灰石骨诱导机理研究》文中指出目前,骨损伤修复存在的主要困难之一是可用于填充缺损和促进骨生长的生物材料非常有限。羟基磷灰石是构成骨骼的主要无机成分,由于具有良好的生物相容性、骨传导性和骨诱导性,现已被广泛应用于人体骨组织修复中。羟基磷灰石的主要制备方法包括化学合成（称之为合成羟基磷灰石）和从骨骼和牙齿、鱼鳞等天然生物体内提取（称之为天然羟基磷灰石）两种方式。合成羟基磷灰石是一个化学分子式为Ca10（PO4）6（OH）2的化学计量材料；而天然羟基磷灰石除了羟基磷灰石的成分以外还包含与骨无机成分相似的微量离子,因此具有与骨矿化成分最大的相似性。目前,基于天然与合成羟基磷灰石医用生物材料均已被广泛使用,但对于天然与合成羟基磷灰石的理化性质的对比研究仍然较少,对于两种材料生物相容性和碱性磷酸酶活性等成骨性能的比较更少,更未见采用蛋白质组学等高通量技术比较和研究其成骨诱导机理的报道。本课题组前期对天然与合成羟基磷灰石进行了制备与表征,然后对天然与合成羟基磷灰石的蛋白吸附特性进行了比较,并进一步通过基因表达谱芯片技术结合生物信息学分析研究了天然羟基磷灰石对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。在前期研究的基础上,本论文将对天然与合成羟基磷灰石的理化性质、生物学性能、骨修复能力及其分子机理进行系统的比较,然后通过对天然羟基磷灰石作用于细胞后的转录组学、蛋白组学和miRNA的联合分析,探讨天然羟基磷灰石诱导骨髓间充质干细胞成骨分化所介导的生物学通路及通路中miRNA的调节作用。本论文包括两个部分的内容,第一部分是天然和合成羟基磷灰石理化性质及生物学性能比较研究,主要内容包括：1)对天然与合成羟基磷灰石粉体和圆盘状试样进行了制备与理化性质的表征,结果显示,与合成HA相比,天然HA中存在特有的碳酸根、磷酸氢根及镁和钠元素；并且天然羟基磷灰石具有更大的单晶尺度和更高的结晶度;此外,浸提液中钙离子的检测表明天然HA可能具有更高的稳定性,而合成HA则具有更高的溶解-沉积特性；镁离子检测表明仅在天然HA组出现镁离子溶出。2)采用贴壁筛选与密度梯度离心分离相结合的方法对小鼠骨髓间充质干细胞进行了分离提取,然后采用流式细胞术进行鉴定了细胞表面标志物和细胞的同质性,结果显示,第4代间充质干细胞高表达细胞粘附因子CD29和CD44,而低表达淋巴细胞标志物CD14和造血细胞标志物CD34,这表明第4代细胞已经得到了纯化,所培养的细胞为骨髓间充质干细胞。3)采用荧光染色和MTT测定方法研究间充质干细胞在天然与合成羟基磷灰石圆盘状试样表面的形貌和增殖情况,结果显示,天然与合成羟基磷灰石表面所培养的细胞形貌相似,与对照组相比材料表面细胞更易呈团聚状生长且增殖缓慢。4)采用基于iTRAQ标记的二维液相色谱串联质谱联用技术对天然与合成羟基磷灰石表面生长细胞的蛋白质表达情况进行研究,在天然与合成羟基磷灰石组24和72小时共鉴定出可信蛋白质800个；对所选蛋白质的表达情况进行Western blot验证显示两种方法所得结果具有较好的一致性,这表明蛋白质组学数据可信。5)对蛋白质数据进行生物信息学分析,结果显示天然与合成羟基磷灰石对细胞主要的GO功能类别影响相似,但在“对无机物质的反应”、“离子跨膜运输”、“生物矿化”和“血管发育”等功能中存在一定的差异；此外,两种材料能够通过特定生物学通路介导细胞的增殖、形貌和分化功能,并且生物学通路之间能够通过蛋白质相互作用网络而相互联系。6)对培养于天然与合成羟基磷灰石表面的细胞进行矿化检测,结果表明两种材料表面细胞的矿化程度均高于对照组,但天然羟基磷灰石能够对矿化作用产生更大的促进作用。第二部分是天然羟基磷灰石成骨诱导机理的转录组学、蛋白质组学和miRNA联合分析,主要内容包括：1)对天然羟基磷灰石对细胞作用的蛋白质组学和基因表达谱芯片数据进行比较,结果显示,两组数据在各时间点的上调表达基因或蛋白质数量均大于下调表达的基因或蛋白质数量；对蛋白质组学数据进行GO功能分析共筛选到4个与成骨分化相关的节点,分别为骨骼发育、细胞分化调控、细胞分化负向调控和细胞分化正向调控。这4个节点包含在基因表达谱芯片数据所涉及的13个与成骨分化相关的节点中。在这4个节点中最终筛选得到10个与成骨分化相关的蛋白质。2)对蛋白质组学数据与基因表达谱芯片数据进行生物学通路联合分析,共得到89条RNA和蛋白质共同参与的生物学通路,其中MAPK信号通路和TGF-β受体信号通路等可能在天然羟基磷灰石所诱导的成骨分化中发挥重要作用。3)对microRNA在天然羟基磷灰石成骨诱导中的调节作用进行分析,结果显示在所检测的13个microRNA中,有9个microRNA在分化相关通路中发挥了调控作用,其中miR-26a和miR-26b可能通过调控成脂分化通路从而对细胞的成脂分化产生抑制作用,而miR-222可能通过调控MAPK通路从而在细胞的成骨分化中发挥重要的促进作用。4)对天然羟基磷灰石的成骨诱导能力进行了检测,碱性磷酸酶染色实验显示培养于天然羟基磷灰石表面的间充质干细胞能够被诱导成骨分化；成骨分化通路验证试验表明,天然羟基磷灰石通过MEK1/2-ERK1/2和JNK MAPK通路共同介导细胞的成骨分化,其中MEK1/2-ERK1/2 MAPK通路在成骨诱导中发挥主要作用。
张凯[7]（2014）在《过度载荷诱导椎间盘退变的力学生物信号研究》文中指出目的1)研究腰椎间盘退变对局部力学环境及邻近结构病理改变的影响，深入理解过度载荷在椎间盘退变过程中的作用。2)研究细胞表面力学感受元件的表达、细胞凋亡水平与椎间盘退变的相关性。3)研究整合素β1在过度载荷诱导的大鼠纤维环细胞凋亡过程中的作用及机制。4)研究ITGB1（整合素β1）基因过表达对周期性牵张载荷诱导的大鼠纤维环细胞凋亡的影响。方法1)建立腰椎间盘退变的有限元模型分析椎间盘退变后局部生物力学环境变化，观察腰椎融合手术的临床效果及手术切除黄韧带组织的病理学改变情况。2)应用SD大鼠腰椎动静力失衡椎间盘退变模型，观察椎间盘退变过程中力学信号感受元件（整合素、DDR2、TRPV4、BK通道）的表达水平及细胞凋亡情况。3)予以纤维环细胞施加过度周期性牵张载荷，观察细胞形态、细胞凋亡率、细胞骨架形态的变化，分析整合素β1的表达及下游信号分子（FAK、Src、ERK、JNK、p38等）的磷酸化水平的变化。4)体外构建慢病毒介导整合素β1（ITGB1基因）过表达载体并转染大鼠纤维环细胞，继而施加过度周期性牵张载荷，观察大鼠纤维环细胞凋亡的变化。结果1)椎间盘退变及手术导致腰椎局部承受异常的力学载荷，黄韧带组织增生纤维化。通过改变局部的生物力学环境可以成功诱导椎间盘的退变。2)整合素β1、DDR2、TRPV4及BK通道等在大鼠的椎间盘组织中均有不同表达，退变的椎间盘组织中整合素β1表达减少、细胞过度凋亡。3)过度牵张载荷刺激后纤维环细胞凋亡增多，其原因可能是应力刺激使细胞膜表面的整合素（主要是β1）功能障碍，继而引起FAK、Src的活性降低，ERK1/2的磷酸化水平降低，JNK、p38磷酸化水平增高，启动了细胞凋亡进程。4)ITGB1基因过表达使周期性牵张载荷诱导的纤维环细胞凋亡率降低。结论椎间盘退变后椎间盘及邻近组织生物力学环境改变；动静力失衡诱导的椎间盘退变与整合素β1表达减少、细胞过度凋亡有关，在过程中整合素β1-FAK/Src-MAPK信号通路发挥了重要作用。ITGB1基因过表达能够部分抑制过度载荷诱导的纤维环细胞凋亡。
王志美[8]（2013）在《ROS及sVCAM-1在突发性感音神经性聋患者血清中的表达及临床意义研究》文中进行了进一步梳理目的：检测突聋患者血清中活性氧（Reactive oxygen species, ROS）和可溶性血管细胞粘附分子-1（Soluble vascular cell adhesion molecule-1, sVCAM-1）的水平,并与正常对照组进行比较,探讨ROS及sVCAM-1在突聋发病机制中的可能作用。方法：采用酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测31例突聋患者与31例正常人血清ROS和sVCAM-1的水平,研究ROS和sVCAM-1的表达与突聋患者性别、年龄、吸烟史、上呼吸道感染、听力下降程度及治疗效果的相关性。结果：1.突聋组血清ROS和sVCAM-1水平较对照组明显升高,差异有统计学意义（p<0.01）；2.突聋患者血清ROS和sVCAM-1的表达呈显着正相关（p<0.05）；3.与年龄小于或等于40岁者比较,年龄大于40岁的突聋患者血清ROS、sVCAM-1水平显着升高,差异有统计学意义（p<0.05）；4.与不吸烟的人群相比较,吸烟的突聋患者血清ROS、sVCAM-1水平显着升高,差异有统计学意义（p<0.05）；5.发病前无上呼吸道感染史患者与发病前有上呼吸道感染史者比较,后者血清ROS、sVCAM-1水平显着升高,差异有统计学意义（p<0.05）；6.治疗有效的患者血清ROS、sVCAM-1水平显着高于治疗无效者,差异有统计学意义（p<0.05）；7.不同性别和不同耳聋程度的突聋患者血清ROS、sVCAM-1水平差异无统计学意义（p>0.05）。结论：1.ROS和sVCAM-1在突聋患者血清中的高表达可能与突聋的发病有关；2.ROS和sVCAM-1的表达水平和突聋患者年龄、吸烟史、上呼吸道感染史和治疗效果呈现相关性,而与突聋患者的性别及耳聋程度无明显相关性。
王建升[9]（2009）在《米非司酮对人早孕绒毛中妊娠相关因子的影响》文中研究指明目的:米非司酮是一种合成类固醇,其结构类似炔诺酮,是孕激素受体的拮抗剂。较早的研究认为,米非司酮使蜕膜发生变性、坏死,胚胎死亡而终止妊娠。随着研究的深入发现米非司酮可直接作用于绒毛滋养层细胞。近年研究表明,着床期的胚胎和子宫内膜除直接受到雌、孕激素的调节外,胚胎和子宫内膜自身还合成和分泌多种着床相关的蛋白因子,如血管内皮生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子、整合素、骨桥蛋白及基质金属蛋白酶等,它们以自分泌或旁分泌方式协调母胎的特殊生理状态。胚泡着床及妊娠成功的建立至少需要经过以下三个过程:（1）胚泡和细胞外基质的粘附;（2）着床部位细胞外基质的降解;（3）穿透细胞外基质。其中第一和第三个过程需要基质蛋白的细胞表面受体如整合素和骨桥蛋白等的参与,第二过程则需要能够降解细胞外基质的相应酶类,如基质金属蛋白酶等的参与。任何影响胚胎植入过程的因素,将导致植入的失败。米非司酮作为孕激素受体拮抗剂,不仅影响孕酮的生物学效应及多种蛋白因子,对妊娠及其产物的代谢和形态结构的影响也是多方面的,但是对于其调节机制尚不十分清楚。另外,目前国内外报道的米非司酮对早孕绒毛中骨桥蛋白及基质金属蛋白酶表达的研究结果也不完全一致。本研究采用免疫组织化学法和荧光定量PCR,研究米非司酮对早孕绒毛中孕激素受体、雌激素受体、骨桥蛋白、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的影响,进一步探讨米非司酮抗早孕机制。材料和方法:将20名要求人工流产的正常妇女随机分为两组,其中10名妇女给予米非司酮150mg,服药后12～24h行负压吸宫术（研究组）,另外10名妇女直接行负压吸宫术（对照组）。负压吸宫术后,即刻收集绒毛组织。采用荧光实时定量聚合酶链反应方法检测两组绒毛组织中雌激素受体和孕激素受体的基因表达;采用免疫组织化学法检测两组早孕绒毛组织的骨桥蛋白、MMP-2和MMP-9的蛋白表达。结果:HE染色结果显示,对照组可见正常早孕绒毛组织形态学;研究组为部分绒毛间质水肿,绒毛组织呈小灶性变性、坏死,炎症细胞浸润;少数细胞核固缩、破碎、细胞质不均匀及空泡变性。免疫组织化学结果显示,骨桥蛋白、MMP-2和MMP-9的阳性表达产物为棕黄色颗粒,主要位于细胞膜和（或）细胞质内,也可见于细胞核上。对照组早孕绒毛组织中合体滋养层细胞、细胞滋养层细胞都显现骨桥蛋白、MMP-2和MMP-9的表达。在绒毛组织中相应部位,研究组骨桥蛋白、MMP-2和MMP-9的表达强度明显减弱。荧光实时定量聚合酶链反应结果表明,研究组绒毛孕激素受体mRNA的表达显着高于对照组（P＜0.01）;两组绒毛雌激素受体mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:1.正常早孕绒毛组织结构完整,米非司酮作用后结构发生改变,绒毛组织变性坏死。表明米非司酮可直接抑制绒毛滋养细胞增生,促进其变性、坏死,从而达到抗早孕的效果。2.服用米非司酮后,早孕绒毛中孕激素受体mRNA的表达量显着上调,而雌激素受体mRNA的表达量无显着变化。这一结果提示米非司酮通过与孕激素受体结合,竞争性拮抗孕激素活性,干扰了雌激素受体、孕激素受体之间的动态平衡,这可能是绒毛组织变性坏死的主要原因。3.研究组早孕绒毛骨桥蛋白的阳性表达显着低于对照组。这一结果提示米非司酮抑制了早孕绒毛中骨桥蛋白的合成,可能使滋养层细胞和蜕膜细胞的黏附、增殖和迁移能力下降,影响了胚泡着床和胎盘的形成,导致流产。4.研究组早孕绒毛MMP-9和MMP-2的阳性表达显着低于对照组。这一结果提示米非司酮抑制了早孕绒毛MMP-9和MMP-2的合成,使绒毛功能减退,难以维持妊娠,最终流产。
努尔比亚·米尔扎木[10]（2009）在《青少年突发性耳聋预后相关因素分析》文中研究指明目的:探讨青年突发性耳聋的临床特点、疗效及影响预后的因素。方法:根据纳入及排除标准,选择2002年1月至2008年1月间曾在新疆医科大学第一咐属医院耳鼻喉科住院的65例青少年突发性耳聋病例作为研究对象,将患者根据性别、年龄、患侧耳、发病季节、听力图形、听力下降程度、发病后开始治疗时间、有无伴眩晕、耳鸣、有无吸烟饮酒史等进行分组,所得数据单因素采用秩和检验,分别比较各组治疗有效率的差异,并用logistic多元回归分析法评价各相关因素对预后的影响。结果:共65例患者（68耳）纳入研究范围;治疗后总有效率为58.5%;单因素分析结果就诊时间、听力下降程度、有无伴眩晕等因素与预后有关（P<0.05）、患者性别、年龄、患侧耳、发病季节、听力图形、有无伴耳鸣、有无吸烟史、饮酒史等与预后无明显相关性（P>0.05）;多个因素的logistic回归分析中,发病至就诊时间、有无伴眩晕与预后有相关性（P<0.05）。结论:在影响青少年突发性耳聋预后的因素中,眩晕,初诊时听力损失程度及开始治疗时间与预后有关。基本符合文献报道的一般性规律,但亦有自身的特点。
二、内耳免疫反应中内耳血管细胞粘附分子-1和α_4-整合素的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、内耳免疫反应中内耳血管细胞粘附分子-1和α_4-整合素的表达（论文提纲范文）
（1）草鱼大脑和垂体中神经肽挖掘及速激肽功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 脊椎动物大脑和垂体研究概况 |
| 2 大脑和垂体中调节机体功能的重要调控因子 |
| 3 速激肽家族研究进展 |
| 4 研究主要目的及意义 |
| 第二章 草鱼大脑与垂体的结构和功能的初步研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 草鱼脑和垂体组织样品获得 |
| 2.4 石蜡组织切片的制作 |
| 2.4.1 常规石蜡切片制作过程 |
| 2.4.2 H.E染色 |
| 2.5 总RNA提取 |
| 2.6 RNA-seq测序、质控、参考序列比对和基因注释 |
| 2.7 差异表达基因的富集分析和组织间关系分析 |
| 2.8 RT-q PCR验证及数据统计分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 草鱼大脑和垂体的整体结构 |
| 3.2 草鱼大脑各亚区和垂体的转录组数据总览 |
| 3.3 草鱼嗅球的显微结构和转录组分析 |
| 3.4 草鱼端脑的显微结构和转录组分析 |
| 3.5 草鱼视顶盖的显微结构和转录组分析 |
| 3.6 草鱼下丘脑的显微结构和转录组分析 |
| 3.7 草鱼小脑的显微结构和转录组分析 |
| 3.8 草鱼延脑的显微结构和转录组分析 |
| 3.9 草鱼垂体的显微结构和转录组分析 |
| 3.10 草鱼各脑区和垂体的关联分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 嗅球可能在免疫响应中起重要作用 |
| 4.2 端脑参与食欲和生殖调节 |
| 4.3 视顶盖在视觉系统和摄食中的重要性 |
| 4.4 下丘脑作为潜在的摄食和生殖的调节中枢 |
| 4.5 草鱼小脑未解之谜 |
| 4.6 延脑在听觉系统中的潜在作用 |
| 4.7 垂体在机体生长、生殖、能量代谢以及器官发育中的重要功能 |
| 4.8 端脑和下丘脑—可能的摄食和生殖调控中枢 |
| 第三章 草鱼大脑和垂体内神经肽及其受体的挖掘和分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.3 草鱼各脑亚区及垂体总RNA提取 |
| 2.4 转录组测序 |
| 2.5 草鱼大脑和垂体内神经肽及其受体的挖掘和转录本表达分布 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 Apelin家族 |
| 3.2 NMB/GRP家族 |
| 3.3 Calcitonin家族 |
| 3.4 CART家族 |
| 3.5 CRH家族 |
| 3.6 CCK/Gastrin家族 |
| 3.7 GRL/MLN家族 |
| 3.8 Glucagon家族 |
| 3.9 GnRH家族 |
| 3.10 INS/IGF家族 |
| 3.11 MCH家族 |
| 3.12 NPP家族 |
| 3.13 NPB/NPW家族 |
| 3.14 NTS家族 |
| 3.15 Neuromedin家族 |
| 3.16 NPY家族 |
| 3.17 Opioid家族 |
| 3.18 HCRT家族 |
| 3.19 PTH家族 |
| 3.20 RFamide家族 |
| 3.21 SST家族 |
| 3.22 TAC家族 |
| 3.23 TRH家族 |
| 第四章 TAC3编码产物在草鱼垂体中的功能及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 转录组测序与生物信息学分析 |
| 2.4 NKBa在草鱼垂体细胞中的功能分析 |
| 2.5 NKBa促进垂体摄食因子表达的受体选择性和信号通路分析 |
| 2.6 草鱼NKBa在体功能验证 |
| 2.6.1 草鱼腹腔注射NKBa |
| 2.6.2 草鱼摄食实验 |
| 2.7 数据分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 NKBa诱导草鱼垂体细胞的转录组分析 |
| 3.2 NKBa对草鱼垂体细胞中CART、UTS1、NMB和 POMCb的调节 |
| 3.3 NKBa诱导草鱼垂体细胞中CART、UTS1、NMB和 POMCb合成的受体选择性实验 |
| 3.4 NKBa诱导CART、UTS1、NMB和 POMCb m RNA表达的受体后信号通路. |
| 3.5 在体实验验证NKBa对草鱼垂体内CART、UTS1、NMB和 POMCb合成的调控作用 |
| 3.6 摄食实验验证NKB与摄食调控的关系 |
| 4 讨论 |
| 第五章 TAC4编码产物对草鱼垂体中摄食肽的调控研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 草鱼TAC4和NKRs的分子克隆和组织表达分析 |
| 2.3.1 总RNA提取与逆转录 |
| 2.3.2 引物设计与PCR扩增 |
| 2.3.3 草鱼TAC4和NKRs序列分析及系统进化树构建 |
| 2.3.4 草鱼TAC4和NKRs的组织表达分布 |
| 2.4 转录组测序与生物信息学分析 |
| 2.5 HKs在草鱼垂体细胞中的功能分析 |
| 2.6 草鱼NKRs在 HEK293T细胞中的功能表达 |
| 2.7 HK1在草鱼垂体中的功能失活分析 |
| 2.8 数据分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 草鱼TAC4和NKRs的基因克隆及序列分析 |
| 3.2 草鱼TAC4和NKRs的组织表达分析 |
| 3.3 草鱼HKs和 NKRs的受体配体选择性实验 |
| 3.4 HK2诱导草鱼垂体细胞的转录组分析 |
| 3.5 HK1和HK2 对草鱼垂体细胞中关键DEGs mRNA表达的调节 |
| 3.6 HK1突变体在草鱼垂体中的功能分析及受体配体验证 |
| 4 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 1 研究总结 |
| 2 创新性 |
| 3 存在问题 |
| 4 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）参芪复方的靶点网络构建及改善胰岛微循环障碍的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 1 选题背景 |
| 2 研究内容 |
| 3 技术路线 |
| 第一部分 网络药理学研究 |
| 1 资料 |
| 1.1 数据来源 |
| 1.2 数据分析 |
| 2 方法 |
| 2.1 技术路线 |
| 2.2 参芪复方活性化合物提取及筛选 |
| 2.3 参芪复方“组分—靶点”可视化分析 |
| 2.4 2型糖尿病“疾病—靶点”筛选 |
| 2.5 2型糖尿病—参芪复方的共表达网络 |
| 2.6 参芪复方治疗T2DM的 PPI分析 |
| 2.7 参芪复方治疗T2DM的GO分析 |
| 2.8 参芪复方治疗T2DM的 KEGG富集分析 |
| 3 研究结果与分析 |
| 3.1 参芪复方“组分—靶点”构建 |
| 3.2 参芪复方治疗T2DM的靶点构建 |
| 3.3 参芪复方治疗T2DM的 PPI分析 |
| 3.4 参芪复方治疗T2DM的GO分析 |
| 3.5 参芪复方治疗T2DM的 KEGG分析 |
| 3.6 参芪复方改善胰岛微循环的靶点与通路预测 |
| 4 小结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 参芪复方改善糖尿病血糖波动大鼠胰岛微循环的疗效评价研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 饲养环境及饲料 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 造模剂配制 |
| 2.2 造模及分组 |
| 2.3 干预方法 |
| 2.4 标本采集与处理 |
| 2.5 观察指标及检测 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3 实验结果及分析 |
| 3.1 一般情况观察 |
| 3.2 血糖波动比较 |
| 3.3 胰岛病理形态学比较 |
| 3.4 胰岛α细胞、β细胞含量比较 |
| 3.5 胰岛细胞凋亡情况比较 |
| 3.6 胰岛微循环情况比较 |
| 3.7 血清ELISA检测比较 |
| 4 小结 |
| 实验二 参芪复方改善糖尿病血糖波动大鼠胰岛微循环分子机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 饲养环境及饲料 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 造模剂配制 |
| 2.2 造模与分组 |
| 2.3 干预方法 |
| 2.4 标本采集与处理 |
| 2.5 激光捕获显微切割 |
| 2.6 胰岛微血管Affymetrix WT芯片 |
| 2.7 Real-time PCR验证 |
| 2.8 Western blot验证 |
| 3 实验结果及分析 |
| 3.1 芯片杂交扫描图 |
| 3.2 组间数据分布集中趋势 |
| 3.3 组间数据差异表达情况 |
| 3.4 非监督层次聚类分析 |
| 3.5 差异基因筛选结果 |
| 3.6 差异基因GO分析 |
| 3.7 差异基因KEGG富集分析 |
| 3.8 胰岛ACE2、IRS-1、AKT1 mRNA表达水平比较 |
| 3.9 胰岛ACE2、Mas1、IRS-1、pan-AKT蛋白表达水平比较 |
| 4 小结 |
| 4.1 差异基因筛选结果 |
| 4.2 差异基因GO及KEGG分析 |
| 4.3 RT-PCR及WB验证结果 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 消渴“从脾论治”的理论探讨 |
| 1.1 消渴理论探源 |
| 1.2 消渴从脾论治 |
| 1.3 参芪复方方义 |
| 2 糖尿病胰岛微循环的西医认知 |
| 2.1 糖尿病是一种慢性复杂性代谢紊乱性疾病 |
| 2.2 血糖波动是导致糖尿病及其并发症的重要因素 |
| 2.3 胰岛微循环障碍是血糖波动的关键环节 |
| 3 关于本研究中动物实验方案的设计 |
| 3.1 立题依据 |
| 3.2 动物模型的建立 |
| 3.3 检测方法的确定 |
| 3.4 评价指标的选择 |
| 4 参芪复方治疗T2DM的网络药理学研究 |
| 4.1 参芪复方治疗T2DM的靶点及通路验证 |
| 4.2 参芪复方治疗T2DM的靶点及通路预测 |
| 4.3 参芪复方改善胰岛微循环的靶点及通路预测 |
| 5 参芪复方改善胰岛微循环的作用探讨 |
| 5.1 参芪复方改善胰岛微循环的疗效评价 |
| 5.2 参芪复方改善胰岛微循环的机制探讨 |
| 6 参芪复方改善胰岛微循环的中医解读 |
| 6.1 糖尿病相关因素的中医学考辨 |
| 6.2 参芪复方改善胰岛微循环的探讨 |
| 7 中医药防治糖尿病的优势 |
| 7.1 执中致和,阴阳平衡 |
| 7.2 务虚求衡,整体辨证 |
| 7.3 养正徐图,调气为先 |
| 第四部分 结论 |
| 创新与特色 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件一:综述 胰岛微循环的中西医研究进展与述评 |
| 参考文献 |
| 附件二:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（3）噪声引起的耳蜗血管纹微血管损伤及蛋白质组学变化（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 噪声引起的耳蜗血管纹微血管损伤的分子机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于iTRAQ技术研究噪声引起的耳蜗血管纹蛋白质组学变化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 平行反应监测技术验证蛋白质组学差异蛋白 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 蛋白质组学研究技术及其在耳科的应用进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）P311在创面血管新生中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 构建P311 蛋白质相互作用网络初步探索其生物学功能 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 P311 在创面血管新生中的作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 P311 促进创面血管新生的机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 蛋白质相互作用网络的构建及应用研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 P311 在组织再生中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述三 VEGF家族成员及其受体在创面血管新生中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）机械牵张应力下Cofilin调节NF-κB对成骨细胞成骨效应影响的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 从机械应力刺激到骨骼形成 |
| 1.1 骨骼的基本结构 |
| 1.2 机械传感器 |
| 2 细胞骨架蛋白与机械力学传导 |
| 2.1 细胞骨架蛋白的基本结构 |
| 2.2 细胞骨架在机械信号转导中的作用 |
| 2.3 ADF/Cofilin蛋白家族对细胞骨架的调控 |
| 2.4 cofilin与机械力学传导 |
| 3 NF-κB与机械力学传导 |
| 3.1 NF-κB蛋白家族 |
| 3.2 NF-κB与机械力学传导 |
| 3.3 NF-κB在成骨细胞中的作用机制 |
| 4 NF-κB与Cofilin间的相互作用机制研究现状 |
| 第一部分 机械牵张应力作用下NF-ΚB对成骨细胞成骨效能的影响 |
| 实验一、成骨细胞内构建NF-ΚB(RELA)过表达及NF-ΚB(RELA)下调模型 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 预实验确定慢病毒转染MG63细胞的MOI(multiplicity of infection)值 |
| 2.3 分别建立稳定过表达RelA、下调RelA的MG63细胞模型 |
| 2.4 实时定量PCR验证慢病毒转染效率 |
| 2.5 Western Blotting检测蛋白表达变化 |
| 2.6 应用嘌呤霉素建立RelA过表达及下调的稳定细胞株 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 确定慢病毒转染MG63细胞的最佳转染条件与MOI |
| 3.2 应用实时定量RT-PCR检测慢病毒转染效果 |
| 3.3 Western Blotting检测慢病毒转染效率 |
| 4 讨论 |
| 实验二、机械牵张应力对过表达NF-ΚB(RELA)的成骨细胞成骨性能的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞加载牵张力 |
| 2.2 酶动力学法检测碱性磷酸酶(ALP)活力 |
| 2.3 茜素红染色检测加力后细胞钙结节形成能力变化 |
| 2.4 应用Elisa检测骨钙素(osteocalcin,OC)、Ⅰ型胶原分泌变化 |
| 2.5 实时定量PCR检测成骨相关基因表达 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同SMS加载时长下,MG63组与RelA过表达MG63组ALP的活性变化 |
| 3.2 不同SMS加载时长下,应用茜素红染色检测MG63组与RelA过表达的MG63组钙结节形成能力 |
| 3.3 不同SMS加载时长下,MG63组与RelA过表达的MG63组分泌骨钙素及Ⅰ型胶原的情况 |
| 3.4 不同SMS加载时长下,MG63组与RelA过表达的MG63组成骨相关基因的表达情况 |
| 4 讨论 |
| 实验三、机械牵张应力对NF-ΚB(RELA)下调的成骨细胞成骨性能的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞加载牵张力 |
| 2.2 酶动力学法检测碱性磷酸酶(ALP)活力 |
| 2.3 茜素红染色检测加力后细胞钙结节形成能力变化 |
| 2.4 应用Elisa检测骨钙素(osteocalcin,OC)、Ⅰ型胶原分泌变化 |
| 2.5 实时定量PCR检测成骨相关基因表达 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同SMS加载时长下,MG63组与RelA过表达MG63组ALP的活性变化 |
| 3.2 不同SMS加载时长下,应用茜素红染色检测MG63组与RelA过表达的MG63组钙结节形成能力 |
| 3.3 不同SMS加载时长下,MG63组与RelA下调MG63组分泌骨钙素及Ⅰ型胶原的情况 |
| 3.4 不同SMS加载时长下,MG63组与RelA下调MG63组成骨相关基因的表达情况 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 机械牵张应力作用下成骨细胞内COFILIN对NF-ΚB的调控机制研究 |
| 实验一、成骨细胞内构建COFILIN过表达及COFILIN下调模型 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 分别建立稳定过表达Cofilin、下调Cofilin的MG63细胞模型 |
| 2.3 实时定量PCR验证慢病毒转染效率 |
| 2.4 WesternBlotting检测蛋白表达变化 |
| 2.5 应用嘌呤霉素建立Cofilin过表达及下调的稳定细胞株 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 应用实时定量RT-PCR检测慢病毒转染效果 |
| 3.2 Western Blotting检测慢病毒转染效率 |
| 4 讨论 |
| 实验二、机械牵张应力对过表达COFILIN的成骨细胞内NF-ΚB的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞加载牵张力 |
| 2.2 Western Blotting检测全蛋白表达变化 |
| 2.3 Western Blotting检测核蛋白表达变化 |
| 2.4 荧光素酶报告基因 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 应用Western Blotting检测细胞全蛋白内IkBα,p-IkBα,IKK和p-p65/NF-kB表达 |
| 3.2 应用Western Blotting检测细胞核蛋白内p-p65/NF-kB表达 |
| 3.3 双荧光素酶报告基因实验 |
| 4 讨论 |
| 实验三、机械牵张应力对COFILIN下调后的成骨细胞内NF-ΚB的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞加载牵张力 |
| 2.2 Western Blotting检测全蛋白表达变化 |
| 2.3 Western Blotting检测核蛋白表达变化 |
| 2.4 荧光素酶报告基因 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 应用Western Blotting检测细胞全蛋白内IkBα,p-IkBα,IKK和p-p65/NF-kB表达 |
| 3.2 应用Western Blotting检测细胞核蛋白内p-p65/NF-kB表达 |
| 3.3 双荧光素酶报告基因实验 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）基于生物组学的羟基磷灰石骨诱导机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 硬组织修复材料研究进展 |
| 1.1.1 硬组织修复材料概述 |
| 1.1.2 硬组织修复用无机生物材料 |
| 1.1.3 硬组织修复用金属材料 |
| 1.1.4 硬组织修复用高分子材料 |
| 1.1.5 硬组织修复用复合材料 |
| 1.2 羟基磷灰石研究进展 |
| 1.2.1 羟基磷灰石的骨传导性和骨诱导性 |
| 1.2.2 羟基磷灰石成骨诱导的研究方法 |
| 1.2.3 羟基磷灰石的来源及其比较 |
| 1.3 间充质干细胞及其成骨分化研究进展 |
| 1.3.1 间充质干细胞的来源、提取方法及表面标志物 |
| 1.3.2 间充质干细胞的培养 |
| 1.3.3 间充质干细胞的分化潜能及各分化方向标志物 |
| 1.3.4 国内关于小鼠骨髓间充质干细胞的分离、提取及分化的相关研究 |
| 1.4 蛋白质组学技术及其生物信息学分析 |
| 1.4.1 蛋白质组学简介 |
| 1.4.2 蛋白质组学研究的主要技术手段 |
| 1.4.3 蛋白质组学数据的生物信息学分析 |
| 1.4.4 系统生物学及不同组学数据的生物信息学联合分析 |
| 1.5 microRNA及其在成骨中的调节作用研究进展 |
| 1.5.1 microRNA简介 |
| 1.5.2 microRNA的研究方法 |
| 1.5.3 microRNA在成骨中的调节作用进展 |
| 1.6 本论文的工作基础和主要研究内容 |
| 1.6.1 本课题组前期工作基础 |
| 1.6.2 本文主要研究内容 |
| 1.7 参考文献 |
| 第一部分 天然和合成羟基磷灰石理化性质及生物学性能的比较研究 |
| 第二章 天然与合成羟基磷灰石材料的制备与表征 |
| 2.1 天然和合成羟基磷灰石粉体及圆盘状试样的制备 |
| 2.1.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 天然和合成羟基磷灰石圆盘状试样的表征 |
| 2.2.1 实验材料与仪器 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.2.3 结果与讨论 |
| 2.3 本章小结 |
| 2.4 参考文献 |
| 第三章 培养于天然与合成羟基磷灰石表面的骨髓间充质干细胞的细胞学研究 |
| 3.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离与提取 |
| 3.1.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.2 小鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养 |
| 3.1.3 骨髓间充质干细胞的流式细胞鉴定 |
| 3.1.4 结果与讨论 |
| 3.2 小鼠骨髓间充质干细胞在天然与合成羟基磷灰石圆盘状试样表面的生长与增殖情况检测 |
| 3.2.1 实验材料与仪器 |
| 3.2.2 细胞在材料表面生长形态的荧光观察 |
| 3.2.3 天然与合成羟基磷灰石表面生长细胞的增殖测定 |
| 3.2.4 统计分析 |
| 3.2.5 实验结果与讨论 |
| 3.3 本章小结 |
| 3.4 参考文献 |
| 第四章 天然与合成羟基磷灰石表面生长细胞的蛋白质组学实验及Western blot验证 |
| 4.1 蛋白质组学预实验 |
| 4.1.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.2 总蛋白提取及蛋白质组学预实验 |
| 4.1.3 蛋白质组学实验中外源高丰度蛋白质的去除实验 |
| 4.2 基于iTRAQ标记的二维液相色谱串联质谱联用技术的蛋白质组学实验 |
| 4.2.1 实验原理 |
| 4.2.2 天然与合成羟基磷灰石圆盘状试样表面的细胞培养与蛋白质收集 |
| 4.2.3 基于iTRAQ标记的二维液相色谱串联质谱联用技术的蛋白质组学实验方法 |
| 4.2.4 结果与讨论 |
| 4.3 蛋白质组学实验的Western blot验证试验 |
| 4.3.1 原理 |
| 4.3.2 Western blot验证试验蛋白质的选择 |
| 4.3.3 实验材料与仪器 |
| 4.3.4 实验方法 |
| 4.3.5 结果与讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第五章 蛋白质组学实验数据的生物信息学分析 |
| 5.1 蛋白质组学数据的聚类分析 |
| 5.1.1 聚类分析及其分析步骤 |
| 5.1.2 聚类分析结果与讨论 |
| 5.2 染色体定位分析 |
| 5.2.1 染色体定位分析及其分析方法 |
| 5.2.2 染色体定位分析的结果与讨论 |
| 5.3 蛋白质组学数据的Gene Ontology(GO)分析 |
| 5.3.1 GO分析及其分析方法 |
| 5.3.2 GOSurfer软件分析结果 |
| 5.3.3 DAVID分析结果 |
| 5.4 蛋白质组学数据的生物学通路分析 |
| 5.4.1 生物学通路分析及其分析方法 |
| 5.4.2 生物学通路分析结果 |
| 5.5 蛋白质组学试验数据的IPA网络分析 |
| 5.5.1 蛋白质相互作用网络分析方法 |
| 5.5.2 蛋白质相互作用网络分析结果与讨论 |
| 5.6 天然与合成羟基磷灰石理化性质与生物学性能的综合分析及验证 |
| 5.6.1 天然与合成羟基磷灰石理化性质与生物学性能的综合分析 |
| 5.6.2 天然与合成羟基磷灰石矿化性能的验证和比较 |
| 5.7 本章小结 |
| 5.8 参考文献 |
| 第二部分 天然羟基磷灰石成骨诱导机理的转录组学、蛋白质组学和microRNA联合分析 |
| 第六章 天然羟基磷灰石对骨髓间充质干细胞作用的蛋白质组学和基因表达谱芯片数据的比较与联合分析 |
| 6.1 基因表达谱芯片和蛋白质组学数据介绍 |
| 6.1.1 本课题组前期基因表达谱芯片实验结果 |
| 6.1.2 天然羟基磷灰石对细胞影响的蛋白质组学实验结果介绍 |
| 6.2 蛋白质组学和基因表达谱芯片数据的比较研究 |
| 6.2.1 基因表达谱芯片与蛋白质组学整体数据比较 |
| 6.2.2 基因表达谱芯片与蛋白质组学数据的相关性分析 |
| 6.2.3 基因表达谱芯片与蛋白质组学数据的组蛋白表达情况比较 |
| 6.3 基因表达谱芯片与蛋白质组学数据的GO功能分析与比较 |
| 6.3.1 GO分析方法 |
| 6.3.2 GO分析结果与讨论 |
| 6.4 基因表达谱芯片与蛋白质组学数据中成骨相关功能节点的对比 |
| 6.4.1 成骨相关功能节点的分析方法 |
| 6.4.2 结果与讨论 |
| 6.5 蛋白质组学与基因表达谱芯片实验数据的生物学通路联合分析 |
| 6.5.1 蛋白质组学与基因表达谱芯片实验数据的生物学通路联合分析方法 |
| 6.5.2 结果与讨论 |
| 6.6 本章小结 |
| 6.7 参考文献 |
| 第七章 microRNA在天然羟基磷灰石成骨诱导中的调节作用分析 |
| 7.1 实验材料与仪器 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验仪器 |
| 7.1.3 溶液配制 |
| 7.2 microRNA表达情况的qRT-PCR实验检测 |
| 7.2.1 microRNA引物的设计和合成 |
| 7.2.2 细胞培养与总RNA提取 |
| 7.2.3 反转录反应 |
| 7.2.4 实时PCR反应 |
| 7.2.5 基因相对表达比值计算 |
| 7.3 统计分析 |
| 7.4 结果与讨论 |
| 7.4.1 microRNA的扩增曲线、溶解曲线 |
| 7.4.2 microRNA的相对表达值 |
| 7.4.3 microRNA调控模式分析 |
| 7.4.4 天然羟基磷灰石诱导骨髓间充质干细胞成骨分化通路与机理分析 |
| 7.5 本章小结 |
| 7.6 参考文献 |
| 第八章 天然羟基磷灰石成骨诱导能力的实验验证 |
| 8.1 不同因素诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化能力的碱性磷酸酶酶检测 |
| 8.1.1 实验原理 |
| 8.1.2 实验材料与仪器 |
| 8.1.3 试验方法 |
| 8.1.4 实验结果与讨论 |
| 8.2 天然羟基磷灰石成骨诱导通路的验证 |
| 8.2.1 实验原理 |
| 8.2.2 实验材料与仪器 |
| 8.2.3 特异性通路阻断剂适宜浓度的选择实验 |
| 8.2.4 通路阻断剂对成骨特异性标志物的影响分析 |
| 8.3 本章小结 |
| 8.4 参考文献 |
| 第九章 总结和展望 |
| 9.1 全文工作总结 |
| 9.2 展望 |
| 9.3 参考文献 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录1 细胞蛋白质的二维凝胶电泳实验(上海中科新生命生物公司提供) |
| 附录2 基于iTRAQ标记的蛋白质组学实验方法(上海博苑生物公司提供) |
| 附录3 Western blot实验方法(南京颂悦生物公司提供) |
（7）过度载荷诱导椎间盘退变的力学生物信号研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 腰椎间盘退变后局部生物力学分析及邻近结构病理改变研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 附 图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 动静力失衡腰椎椎间盘退变模型的建立及整合素Β1表达与细胞凋亡在椎间盘退变中的意义 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 周期性牵张载荷对 SD 大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡和整合素Β1 表达的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第四部分 慢病毒介导的 ITGB1 过表达对周期性牵张载荷诱导的大鼠纤维环细胞凋亡的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 1.总结 |
| 2.展望 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文及其他 |
（8）ROS及sVCAM-1在突发性感音神经性聋患者血清中的表达及临床意义研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 目录 |
| 1 绪论 |
| 2 对象与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要设备 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 方法与步骤 |
| 2.4.1 清提取 |
| 2.4.2 清ROS、sVCAM-1水平的检测 |
| 2.5 数据分析及统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 突聋组与对照组血清ROS水平比较 |
| 3.2 突聋组与对照组血清sVCAM-1水平比较 |
| 3.3 ROS、sVCAM-1两者的相关性分析 |
| 3.4 突聋组内不同分组的患者血清ROS水平比较 |
| 3.5 突聋组内不同分组的患者血清sVCAM-1水平比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 内耳微循环障碍对突聋发病的影响 |
| 4.2 ROS和sVCAM-1在突聋发病中的作用 |
| 4.3 ROS和sVCAM-1在突聋发病中的作用机理 |
| 4.4 ROS和sVCAM-1对突聋发病及预后的影响 |
| 4.5 展望 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 综述 |
| 参考文献 |
| 8 致谢 |
（9）米非司酮对人早孕绒毛中妊娠相关因子的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略语 |
| 文献综述 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）青少年突发性耳聋预后相关因素分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 2. 研究方法 |
| 3. 治疗方法 |
| 4. 统计分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读硕士学位期间发表的学位论文 |
| 导师评阅表 |
四、内耳免疫反应中内耳血管细胞粘附分子-1和α_4-整合素的表达（论文参考文献）
- [1]草鱼大脑和垂体中神经肽挖掘及速激肽功能鉴定[D]. 叶城. 华中农业大学, 2020(02)
- [2]参芪复方的靶点网络构建及改善胰岛微循环障碍的实验研究[D]. 周秀娟. 成都中医药大学, 2019(04)
- [3]噪声引起的耳蜗血管纹微血管损伤及蛋白质组学变化[D]. 唐朝颖. 中国人民解放军医学院, 2019(02)
- [4]P311在创面血管新生中的作用及机制研究[D]. 王淞. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [5]机械牵张应力下Cofilin调节NF-κB对成骨细胞成骨效应影响的分子机制研究[D]. 牛茜楠. 中国人民解放军空军军医大学, 2018(04)
- [6]基于生物组学的羟基磷灰石骨诱导机理研究[D]. 张志伟. 东南大学, 2015(08)
- [7]过度载荷诱导椎间盘退变的力学生物信号研究[D]. 张凯. 上海交通大学, 2014(07)
- [8]ROS及sVCAM-1在突发性感音神经性聋患者血清中的表达及临床意义研究[D]. 王志美. 中南大学, 2013(05)
- [9]米非司酮对人早孕绒毛中妊娠相关因子的影响[D]. 王建升. 中国协和医科大学, 2009(S1)
- [10]青少年突发性耳聋预后相关因素分析[D]. 努尔比亚·米尔扎木. 新疆医科大学, 2009(S2)