一、凋亡抑制蛋白(IAPs)与恶性肿瘤（论文文献综述）
王舒婕[1]（2021）在《Betatrophin通过调控ISL-1促进成体胰岛β细胞增殖的研究》文中认为[目的]Betatrophin是由肝脏分泌的激素样蛋白质,有研究报道其可促进正常成体胰岛β细胞增殖。目前研究发现多数胰岛相关疾病都涉及胰岛β细胞数量及功能的改变。我们前期研究发现ISL-1在成体胰岛β细胞中具有重要的抗凋亡和促增殖双重功能,其在磷酸化状态下发挥抗凋亡功能,而在去磷酸化状态下发挥促增殖功能。但ISL-1发挥双重功能时的上游调控分子仍不清楚,本研究重点为明确Betatrophin是否通过调控ISL-1及磷酸化状态下的ISL-1（p-ISL-1）从而影响成体胰岛β细胞的增殖,探索Betatrophin通过何种途径调控ISL-1表达,为胰岛相关疾病提供基础理论并为临床研究提供新的思路。[方法]首先,使用慢病毒包装系统在HIT-T15及NIT-1细胞中构建Betatrophin过表达稳转细胞株,并经嘌呤霉素筛选及扩大培养后,通过Western Blot、Real-time RT-PCR对稳转株细胞进行鉴定,在蛋白质和mRNA水平检测Betatrophin表达。其次,使用已构建成功的Betatrophin过表达稳转细胞株HIT-T15 Betatrophin OE、NIT-1 Betatrophin OE 以及各自的对照组细胞,通过 Western Blot 和 Real-time RT-PCR检测ISL-1和p-ISL-1的表达,通过MTS法及EdU掺入实验检测细胞增殖情况,通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平,通过Co-IP检测ISL-1促增殖复合体ISL-1/Set7/9/PDX-1 及抗凋亡复合体 ISL-1/MDM2/P53中PDX-1及P53的表达水平。最后,结合生物信息学分析,筛选Betatrophin在正常胰岛β细胞中可能的相关因子,并通过Co-IP方法证实该蛋白质-蛋白质相互作用。使用信号通路特异性抑制剂阻断该相互作用后,通过Western Blot和Real-time RT-PCR检测ISL-1和磷酸化ISL-1的表达。[结果]第一,构建 Betatrophin 过表达的 HIT-T15 Betatrophin OE 和 NIT-1 Betatrophin OE稳转细胞株,与HIT-T15细胞对照组相比,过表达Betatrophin后,Betatrophin mRNA和蛋白表达量分别升高了4.16倍（p<0.01）和3.11倍（p<0.001）;与NIT-1细胞对照组相比,过表达Betatrophin后,BetatrophinmRNA和蛋白表达量分别升高了12.52倍（p<0.01）和78.1%（p<0.001）,并且在细胞培养基中检测到Betatrophin,提示过表达 Betatrophin 的 HIT-T15 Betatrophin OE 和 NIT-1 Betatrophin OE稳转细胞株构建成功。第二,Betatrophin过表达的HIT-T15细胞,其ISL-1 mRNA表达量升高了 1.78倍（p<0.01）,ISL-1蛋白表达量升高了 40%（p<0.01）,p-ISL-1蛋白表达量降低了 49.0%（p<0.001）;Betatrophin 过表达的 NIT-1 细胞,其 ISL-1 mRNA 表达量升高了 7.8 倍（p<0.001）,ISL-1 蛋白表达量升高了 1.71 倍（p<0.001）,p-ISL-1 蛋白表达量降低了 60.3%（p<0.001）。提示Betatrophin可促进ISL-1表达并降低ISL-1第33位丝氨酸磷酸化。第三,过表达Betatrophin,MTS法提示胰岛β细胞增殖速度加快。EdU掺入实验显示过表达Betatrophin后,与对照组相比,HIT-T15细胞EdU阳性细胞数增加了 34.01%（p<0.01）,NIT-1 细胞 EdU 阳性细胞数增加了 79.33%（p<0.05）。过表达Betatrophin,与对照组相比,HIT-T15细胞凋亡率降低了 24.2%（p<0.0001）,NIT-1细胞凋亡率降低了 32.1%（p<0.0001）。表明Betatrophin可促进胰岛β细胞增殖并增强其抗凋亡能力。第四,过表达Betatrophin,ISL-1促增殖复合体中的促增殖组分PDX-1表达升高,ISL-1抗凋亡复合体中的抗凋亡组分P53表达下降。第五,Betatrophin与P110存在蛋白质-蛋白质相互作用。第六,在加入PI3K-Akt信号通路抑制剂LY294002后,与对照组相比,过表达Betatrophin的HIT-T15细胞,其ISL-1的mRNA 表达量降低了 42.5%（p<0.0001）,ISL-1蛋白表达量降低了40%（p<0.001）,p-ISL-1蛋白表达量升高了 34.78%（p<0.001）;过表达Betatrophin的NIT-1细胞,其ISL-1的mRNA表达量降低了53.7%（p<0.01）,ISL-1 蛋白表达量降低了 62.1%（p<0.001）,p-ISL-1 蛋白表达量升高了 35.29%（p<0.001）。表明Betatrophin通过介导PI3K-Akt信号通路调控ISL-1表达及ISL-1磷酸化修饰。[结论]1.Betatrophin通过促进ISL-1的表达与降低ISL-1磷酸化水平,从而调控ISL-1的生物学功能,进而促进胰岛β细胞增殖。2.Betatrophin通过介导PI3K-Akt通路调控ISL-1表达及翻译后修饰。
黄莉[2]（2020）在《PEITC调控结肠癌凋亡的机制研究及安全性评估》文中认为结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,发病率占所有恶性肿瘤第三位,死亡率位于第五位,给人类的健康带来了巨大的威胁。结肠癌的病因不明确,发病机制十分复杂,早期基本无症状。手术是治疗结肠癌的主要方法,早期患者可以通过手术达到根治的效果,而中晚期患者通过手术很难根治,手术后容易转移或者复发。而针对不能进行手术的患者,以化疗为基础的综合治疗模式可以有效改善患者生存。异硫氰酸苯乙酯（PEITC）是十字花科植物的硫代葡萄糖苷降解产物,被报道可以降低肿瘤的发生率,抑制肿瘤细胞的增殖和生长,且对正常组织细胞无任何毒副作用。目前研究认为诱导细胞凋亡是PEITC可以抑制癌细胞增殖的重要机制,而理解PEITC诱导的细胞凋亡机制对于了解其作为临床上有用的化学预防或治疗剂是必不可少的。我们前期发现PEITC抑制结肠癌细胞增殖并诱导其凋亡,并且对正常肠的上皮细胞无影响,但其机制尚不清楚。因此,本论文将深入研究PEITC诱导细胞凋亡的途径及其分子机制,并通过裸鼠成瘤模型验证PEITC对结肠癌肿瘤的抑制效果和作用机制,最后对PEITC的安全性进行评价。我们选用了 2种不同的结肠癌细胞系（HCT116和SW620）及正常肠上皮细胞（NCM460）,用不同浓度的PEITC进行处理,通过MTT法、流式细胞仪、克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验,发现20 μM PEITC的PEITC可以显着性抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进结肠癌细胞凋亡,而对正常肠上皮细胞无影响。我们进一步通过western blot实验发现PEITC促进Caspase-3和Caspase-9的表达,通过JC-1和DCFH-DA方法发现PEITC抑制线粒体内膜膜电势并促进ROS产生,提示通过线粒体途径诱导细胞凋亡。我们分离细胞质组分后通过western blot检测Cyto-c和SMAC的表达,发现PEITC促进结肠癌细胞SMAC的表达,流式细胞仪结果进一步表明PEITC通过SMAC诱导结肠癌细胞凋亡。通过anti-SMAC进行免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,co-IP）实验发现PEITC作用后可促进SMAC与Survivin的相互作用,发挥诱导细胞凋亡作用。PEITC通过ERK和JNK蛋白的磷酸化促进凋亡相关蛋白表达及增加细胞凋亡比例,表明PEITC通过ERK/JNK通路介导结肠癌细胞凋亡。利用结肠癌裸鼠成瘤模型评价PEITC的抑癌效果及安全性,通过皮下接种法建立裸鼠成瘤模型,发现PEITC抑制结肠癌皮下移植肿瘤的生长,并促进裸鼠结肠癌皮下肿瘤中线粒体途径凋亡相关蛋白Caspase-9、SMAC蛋白表达,抑制Survivin蛋白表达,对裸鼠血常规三系细胞和肝肾功能均无影响。我们研究表明PEITC通过SMAC/Survivin信号通路调控线粒体途径诱导的结肠癌细胞凋亡。体内实验证明PEITC抑制裸鼠皮下移植肿瘤的生长,并通过SMAC/Survivin信号介导线粒体途径的凋亡,而不影响裸鼠肝肾功能、血常规三系细胞。本论文将为结肠癌的临床治疗提供新的理论基础和新的方向。
王舒婕,刘文静,杨哲[3]（2020）在《具有泛素连接酶活性的凋亡抑制蛋白影响恶性肿瘤的发生与发展》文中研究说明凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis proteins,IAPs）是一类高度保守的内源性凋亡抑制蛋白因子家族。近年研究发现,其中具有RING结构域的成员可发挥泛素连接酶（ubiquitin-ligase,E3）功能,通过抑制胱天蛋白酶（caspase）活性和参与MAPKs（mitogen-activated protein kinases）与NF-κB（nuclear factor kappa-B）信号活性调节,在恶性肿瘤的发生发展进程中发挥重要作用。IAPs在恶性肿瘤中的作用机制复杂多样,涵盖了恶性肿瘤的基本特征包括细胞死亡抵抗、炎症反应及侵袭转移等。其通过内源性途径和外源性途径抑制肿瘤细胞凋亡;促进炎症反应及调控免疫应答;既可促进肿瘤细胞迁移也可抑制肿瘤细胞迁移等。在大多数恶性肿瘤中,IAPs与不良预后正相关,少数恶性肿瘤中IAPs与不良预后负相关。以上研究表明,深入研究IAPs与恶性肿瘤的发生发展及与病人预后的相关性将尤为必要。因此,本文着重对IAPs家族中具有E3活性成员,特别是XIAP（X-chromosome linked IAP）、c-IAP1（cellular IAP1）、c-IAP2（cellular IAP2）和ML-IAP（melanoma IAP）的结构和其在恶性肿瘤中的功能、所参与信号传导途径以及其与恶性肿瘤发生发展与预后的相关性进行综述,总结了目前针对IAPs的抗肿瘤药物及治疗方法的研究进展。并进一步探讨IAPs相关研究中存在的问题与挑战,以期为未来的研究提供新的方向和策略。
张荣新[4]（2020）在《新型放疗增敏多肽ANTP-SmacN7对肺癌细胞的辐射增敏作用及机制研究》文中指出研究背景恶性肿瘤的发病率逐年升高,为人类致死的主要原因之一。放射治疗做为治疗恶性肿瘤的三大主要手段之一,其作用和地位日益突出。然而肿瘤细胞在放疗过程中的辐射耐受成为限制放疗疗效的主要问题,肿瘤细胞的辐射增敏研究成为近年来的研究热点。肿瘤细胞内凋亡抑制蛋白IAPs（Inhibitors of Apoptosis Proteins,IAPs）的过表达已被证实为与肿瘤的辐射耐受密切相关,其高表达会抑制细胞凋亡,降低肿瘤的辐射敏感性。第二个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂（Smac,Second mitochondria-derived activator of caspase）可以与IAPs直接结合,拮抗其抑制凋亡的功能,从而促进细胞凋亡、提高肿瘤的放疗敏感性。Smac蛋白类似物作为一种促凋亡蛋白,在受到凋亡诱导因素（射线辐射、抗癌药物、化学信号、紫外线和其他DNA损伤等）的作用时,可与其他线粒体蛋白（如细胞色素-c等）穿透线粒体膜释放到胞浆中参与凋亡调节,可显着提高辐射诱导的肿瘤细胞凋亡,有望成为一种新型肿瘤辐射增敏药物。Smac氨基端的7个氨基酸残基---Smac N7,是Smac蛋白中最小的活性单元,能够抑制IAPs而发挥辐射增敏作用,但正常条件下Smac N7单独无法顺利进入细胞。有研究证实,果蝇Antennapedia蛋白（ANTP）同源结构域的位列第3位的α-螺旋结构区域（43到58之间共16个氨基酸残基基团）是具有转导作用的最小功能区域,该蛋白可直接与脂质双分子层结合、实现跨膜运动从而进入胞内,而不依赖通道、介体、通路或胞吞作用,不消耗能量。本实验选择ANTP蛋白作为引导肽,合成ANTP-Smac N7融合多肽,在引导肽的作用下,使功能肽Smac N7进入肿瘤细胞,观察其促进肺癌细胞凋亡、辐射增敏作用。本实验项目意在探索能够提高肿瘤放疗疗效的新型辐射增敏药物。目的本研究旨在探讨新型Smac蛋白类似物ANTP-Smac N7融合肽对肺癌细胞系A549的辐射增敏作用,分析其潜在的作用机制,为肺癌的放疗辐射增敏提供理论基础。分析肺癌细胞系A549细胞及H460细胞Smac蛋白、IAPs家族蛋白表达与辐射敏感性的关系。内容本研究分三个部分第一部分:用ANTP蛋白的ANTP9多肽作为引导肽,Smac N7做为功能肽,合成ANTP-Smac N7融合多肽。在融合蛋白羧基末端用FITC（异硫氰酸酯荧光素）进行标记,以便于观察该融合蛋白是否具有细胞穿透的功能。取对数期生长的细胞,培养过程中加入ANTP-Smac N7融合多肽。用DAPI溶液染色作为对照组,确定细胞核的位置。倒置荧光显微镜下观察融合多肽进入细胞的情况。第二部分:对数生长期肺癌A549细胞进行分组,分为空白对照组,单纯照射组,ANTP组,Smac N7组,ANTP-Smac N7组和照射联合ANTP-Smac N7组等实验组。ANTP-Smac N7组、照射联合ANTP-Smac N7组中ANTP-Smac N7的浓度为20μmol/L。通过克隆实验观察ANTP-Smac N7融合多肽的辐射增敏作用。细胞凋亡实验流式细胞仪测定不同组细胞处理后的细胞凋亡率。应用彗星实验检测DNA损伤程度。采用尾矩（Tail moment,TM）、尾部DNA含量（Tail DNA%,TDNA%）以及Olive尾矩（Olive Tail Moment,OTM）来评价分析指标定量检测ANTP-Smac N7融合多肽对辐射诱导的A549细胞DNA损伤的作用。Western blot实验检测Cyto-C、PARP、caspase8、caspase3、caspase9的活化表达水平。给予caspase抑制剂z-VAD（不可逆泛caspase-inhibitor）后,克隆实验检测融合多肽对辐射增敏作用的变化,Western blot法比较PARP、γ-H2AX表达差别。分析ANTP-Smac N7融合多肽辐射增敏的可能机制。第三部分:相同实验条件下比较A549与H460两种肺癌细胞株的辐射敏感性,Western blot实验检测两种细胞Smac,XIAP,c IAP1,c IAP2蛋白的表达量,通过两种肺癌细胞不同IAP家族部分蛋白XIAP、Smac的表达量,分析两者不同辐射敏感性的可能机制。为进一步的动物和临床实验打下一定的理论基础。结果第一部分:在ANTP的帮助下,Smac N7功能肽可顺利进入细胞内,并在肿瘤细胞蓄积到一定浓度。这为下一步融合多肽顺利进入细胞、发挥作用做好铺垫,使下一步的实验得以进行。第二部分:1.照射+ANTP-Smac N7组的克隆形成率明显降低,差异有统计学意义A融合多肽能够增强A549细胞的辐射敏感性（p<0.01）。2.ANTP-Smac N7单独作用时对细胞的促凋亡作用不明显,在联合组,融合多肽促凋亡作用在辐射的基础上明显增高。3.照射+ANTP-Smac N7融合肽组TDNA%、TM和OTM均高于其他各组,差异有统计学意义（均p<0.05）,表明ANTP-Smac N7融合多肽显着增强电离辐射诱导的DNA损伤。4.Western blot检测不同实验组肺癌A549细胞caspase、PARP蛋白表达水平,实验结果表明ANTP-Smac N7融合多肽促进辐射诱导细胞凋亡caspase的活化,增加C-PARP表达水平,发挥对A549细胞的辐射增敏作用。5.加入Caspase抑制剂z-VAD后融合多肽对A549细胞辐射增敏作用减弱,细胞存活率曲线介于单纯照射组与照射联合ANTP-Smac N7融合多肽组之间。6.ANTP-Smac N7融合肽明显增加辐射导致的A549细胞DNA双链断裂,给予caspase抑制剂z-VAD可降低细胞凋亡,但不能减少DNA双链断裂水平。第三部分:A549细胞存活率高于H460细胞,辐射耐受性强于H460。A549细胞Smac低表达,而XIAP高表达。A549细胞中凋亡抑制蛋白（IAPs）家族中另外两个蛋白c IAP1和c IAP2的表达量都不高。结论ANTP-Smac N7融合多肽可以顺利进入肺癌肿瘤细胞内,ANTP-Smac N7融合肽可显着增强电离辐射诱导的DNA损伤,促进辐射诱导细胞凋亡caspase3,8,9的活化,明显提高A460细胞的辐射敏感性。ANTP-Smac N7融合多肽为一种新的Smac蛋白类似物有望用于肿瘤的辐射增敏治疗。A549细胞Smac低表达,而XIAP高表达,正是其产生辐射耐受性强于H460的分子基础。
魏海玲[5]（2020）在《BV6联合顺铂及mTOR对卵巢癌化疗增敏作用的研究》文中研究表明目的1.在动物实验水平,研究BV6单独用药或联合顺铂、m TOR抑制剂及m TOR激动剂等药物,是否能提高卵巢癌SKOV3移植瘤的化疗敏感性,减少药物的毒副作用。2.为BV6为代表的Smac模拟物可增敏化疗、降低毒副反应提供依据,为后续BV6为代表的Smac模拟物在临床中应用奠定实验基础。方法1.培养卵巢癌SKOV3细胞。2.构建卵巢癌裸鼠移植瘤模型。3.裸鼠移植瘤模型建立后随机分成6组:对照组、DDP组、BV6组、BV6+DDP+m TOR激动剂（MHY1485）组、DDP+BV6组、BV6+DDP+m TOR抑制剂（Rapamycin）组,每组分别给药。4.观察不同组别不同周期用药后裸鼠的体重及移植瘤大小,观察药物对裸鼠的副作用。5.分组给药观察4周后,处死荷瘤裸鼠,提取肿瘤组织,观察各组裸鼠发生内脏器官转移及腹水情况。绘制肿瘤生长曲线,计算抑瘤率。结果1.治疗前各组间裸鼠体重无统计学差异（P>0.05）。2.分组给药观察4周后,比较各组裸鼠移植瘤体积变化情况:2.1给药前各组间移植瘤体积大小无显着统计学差异（P>0.05）;2.2治疗后DDP+BV6组比DDP组移植瘤体积小,差异较显着（P<0.05）;2.3治疗后BV6+DDP+m TOR抑制剂组比DDP+BV6组移植瘤体积小,有统计学意义（P<0.05）,各组间BV6+DDP+m TOR抑制剂组移植瘤体积最小,有统计学意义（P<0.05）;2.4治疗后BV6+DDP+m TOR激动剂组移植瘤体积小于DDP+BV6组、大于BV6+DDP+m TOR抑制剂组但均无统计学差异（分别P=0.083及P=0.261）;2.5实验结束时含有BV6的4组实验组比不含BV6的2组实验组移植瘤体积要小,该差异有统计学意义（P<0.05）;2.6用药后对照组较各治疗组裸鼠肿瘤体积大,有统计性差异（P<0.05）。3.实验结束时各组裸鼠均存活,处死后均未发现腹水及内脏器官肿瘤转移。结论1.BV6单独应用或与其他药物联合应用对卵巢癌细胞SKOV3裸鼠皮下移植瘤均可起到抗肿瘤增殖作用。其中以BV6+DDP+m TOR抑制剂联合应用抑制肿瘤增殖作用最明显。2.单用DDP对SKOV3裸鼠皮下移植瘤有抗肿瘤增殖作用,但效果不显着。3.实验用药过程中未发现明显与BV6相关的毒副作用。BV6可增加卵巢癌对DDP的化疗敏感性,可能对降低卵巢癌铂类耐药有一定作用。4.m TOR抑制剂在卵巢癌联合化疗中对BV6及DDP抑制肿瘤的增殖有促进作用,未见明显毒副作用。
夏淑敏[6]（2020）在《爱康方对人肺鳞癌SK-MES-1细胞内mTOR及相关凋亡蛋白影响的机制研究》文中研究表明目的课题组前期研究已充分表明爱康方含药血清能诱导SK-MES-1细胞凋亡,本实验在此基础上,继予20%最佳浓度含药血清干预该细胞,观察爱康方含药血清对人肺鳞癌SK-MES-1细胞内Caspase-9、Bad、Survivin、mTOR蛋白表达及mRNA水平的影响,进一步探讨该方促进肺癌细胞凋亡可能的分子机制。方法将60只体重在220±20克的SPF级SD雄性大鼠采用随机分组的方式分为生理盐水对照组、环磷酰胺组、爱康方组以及爱康方联合环磷酰胺组,每组15只。按照前期课题组制备含药血清的方式,分别对以上四组大鼠进行生理盐水灌胃、环磷酰胺腹腔注射、爱康方灌胃以及爱康方灌胃联合环磷酰胺腹腔注射5天后制备含药血清。培养SK-MES-1细胞后,根据所加的不同组含药血清,将细胞分为:空白对照组（只加DMEM完全培养基）、对照组（生理盐水组）和实验组（爱康方组、环磷酰胺组、爱康方联合环磷酰胺组）。将细胞分别培养24小时,采用免疫细胞化学法、蛋白免疫印迹（Western blot）法检测Caspase-9、Bad、Survivin、mTOR蛋白表达,采用Real-time PCR法检测Caspase-9、Bad、Survivin、mTOR mRNA水平。结果1.爱康方对SK-MES-1细胞中Caspase-9、Bad蛋白表达及mRNA水平的影响免疫细胞化学法及Western blot法检测Caspase-9、Bad蛋白表达水平:实验组蛋白表达高于生理盐水对照组（P<0.05）;实验组间比较,环磷酰胺组蛋白表达高于爱康方组（P<0.05）,爱康方联合环磷酰胺组蛋白表达高于环磷酰胺组,差异有统计学意义（P<0.05）。Real-time PCR法检测Caspase-9、Bad mRNA水平:实验结果示,在Caspase-9和Bad中各实验组mRNA水平高于生理盐水对照组（P<0.05）;实验组间比较,环磷酰胺组mRNA水平高于爱康方组（P<0.05）,爱康方联合环磷酰胺组mRNA水平高于环磷酰胺组,差异有统计学意义（P<0.05）。2.爱康方对SK-MES-1细胞中Survivin、mTOR蛋白表达及mRNA水平的影响免疫细胞化学法及Western blot法检测Survivin、mTOR蛋白表达水平:实验组蛋白表达低于生理盐水对照组（P<0.05）;实验组间比较,环磷酰胺组蛋白表达低于爱康方组（P<0.05）,爱康方联合环磷酰胺组蛋白表达低于环磷酰胺组,差异有统计学意义（P<0.05）。Real-time PCR法检测Survivin、mTOR水平:实验结果示,在Survivin和mTOR中各实验组mRNA水平均低于生理盐水对照组（P<0.05）;实验组间比较,环磷酰胺组mRNA水平低于爱康方组（P<0.05）,爱康方联合环磷酰胺组mRNA水平均低于环磷酰胺组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.爱康方及爱康方协同环磷酰胺可以提高人肺鳞癌SK-MES-1细胞中Caspase-9和Bad蛋白表达和mRNA水平。2.爱康方及爱康方协同环磷酰胺可以降低人肺鳞癌SK-MES-1细胞中Survivin和mTOR蛋白表达和mRNA水平。3.爱康方可能通过调节细胞凋亡相关蛋白Caspase-9、Bad、Survivin的表达以及通过调节mTOR的表达从而抑制PI3K/AKT/mTOR信号转导途径来促进人肺鳞癌SK-MES-1细胞的凋亡,且该方与环磷酰胺发挥一定的协同作用。
骆诤[7]（2019）在《BIRC5基因型在肝癌中的分布及miR-218靶向BIRC5对肝癌细胞侵袭能力影响的分子机制研究》文中研究指明背景:肝癌,作为一种高发病率,高死亡率的消化系统肿瘤,严重影响了大多数患者的生活质量。随着新药的不断出现,肝癌的治疗虽然取得了长足的进展,但其预后仍较差,5年生存率仅约10%。肝癌难以通过早期检查发现,且患病早期病患多无明显症状,多数病人就诊时已属晚期,失去手术彻底根治机会。肝癌的复发转移率高是肝癌预后效果差的主要原因,肝癌转移是一个多因素的复杂过程,其过程最主要包含上皮细胞极性转变、肿瘤细胞间黏附变化,运动能力加强,穿透基底膜,血管生成等。已有研究证明多种粘附分子、基质金属蛋白酶、细胞因子及其所参与的信号转导、癌基因和抑癌基因的表达和调控的改变均涉及到肝癌转移的过程。上皮-间质转化是指在某些特殊的生理或病理条件下,具有极性的上皮细胞失去极性,转换成具有活动能力、在细胞基质中自由移动的间质细胞的过程。在肿瘤的发展中,上皮-间质转化令原本不具有迁徙及侵袭能力的细胞获得浸润能力,并最终转移到其他组织和器官,从而使肿瘤形成局部浸润和远端转移,并再次通过间质-上皮转化定植于转移灶。Wnt/β-catenin信号通路被证明多种关键的不可忽略的调节作用,尤其在骨骼发生、发育与再生的各个阶段,Wnt信号通路扮演着十分活跃的角色。有研究表明,上调的β-catenin将进人细胞核与TCF/LEF信号通路发生作用,激活下游众多的靶基因过度表达,与EMT的发生有直接关联。糖原合成酶激酶-3β是Wnt/β-catenin信号通路的组成因子之一。有研究表明,GSK-3β可通过降解β-catenin抑制肿瘤生长,并通过抑制Wnt通路调节肿瘤细胞死亡增殖和凋亡。而BIRC5被普遍认为是Wnt/β-catenin的靶基因之一。生存素（survivin）是凋亡抑制蛋白家族 IAPs（inhibitor of apoptosis proteins）中抗凋亡作用最强,但结构最简单的蛋白。其基因BIRC5位于17q25,长14.7 kb,具有3个内含子及4个外显子,含有一个杆状病毒IAPs的重复序列。BIRC5在胎儿组织和各种人类恶性肿瘤组织中大量表达,但在正常组织或分化良好的成人组织中无表达。既往研究发现,BIRC5基因在肝癌中高表达,并且和肝癌患者不良的预后相关。敲低BIRC5基因会抑制肿瘤细胞的增殖,促进凋亡。miR-218已证实是DNA损伤修复基因,是核苷酸切除修复（NER）途径的限速酶,NER是DNA修复通路之一。NER可以识别修复紫外线损伤的及化学药物损伤的DNA双链螺旋结构。NER通过解开受损部分DNA的双螺旋结构,切除受损部分,重新合成受损部分使其连接于未受损的DNA结构上。研究发现BIRC5基因的mRNA可编码由297个氨基酸组成的蛋白质,其具有核苷酸切除修复的作用。基因BIRC5的表达与DNA的修复酶缺乏基因形成紧密的异二聚体存在,在核苷酸切除修复途径中作为一个整体,具有切除DNA 5’端和识别损伤的双向作用,同时还具有5’-3’核苷酸内切酶活性,在核苷酸切除修复中起到限速或调节的重要作用,而核苷酸切除修复过程需要miR-218的参与。目的:本课题针对我国人群,采用病例对照研究方法,分析我国肝癌的发病相关危险因素,采用分子生物学和传统的流行病学方法相结合,研究BIRC5基因型在肝癌中的分布,并在分子水平上研究miR-218靶向BIRC5并调节GSK-3 β/β-catenin通路对肝癌细胞侵袭转移能力及其他恶性生物学特征的影响。方法:本研究选取2014年1月-2016年12月在山东省立医院住院的204例肝癌患者作为研究对象,年龄在37-78岁范围;所有参与者均获取知情同意并签字。通过MassARRAY技术检测BIRC5基因的SNP位点,并对miR-218靶向蛋白BIRC5与肝癌患病风险进行相关性分析。通过miR-218模拟物（mimic）和阻遏物（inhibitor）转染构建相关细胞系并通过qPCR检测miR-218的表达。经转染后,通过双荧光素酶报告实验证明了 BIRC5与miR-218之间的靶标关系,并通过Western Blot检测EMT相关标志物的蛋白水平。细胞克隆形成实验检测了miR-218是否影响HepG2细胞的克隆形成能力,Transwell小室实验检测了各转染组细胞的侵袭转移情况,CCK8检测miR-218是否影响HepG2细胞的增殖能力,流式凋亡检测方法及免疫荧光实验检测miR-218是否影响HepG2细胞的凋亡,并进一步通过Western blot研究了 miR-218对GSK-3β/β-catenin通路的调控作用。同时,通过裸鼠成瘤实验及HE染色验证了 miR-218对肝癌瘤体的抑制作用。结果:1.BIRC5 rs3212986rs2298881,rs1 1615 和 rs6498486 基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡遗传平衡定律（P>0.05）,其SNP中的MAF与NCBI中的dbSNP数据库中所描述的普通中国人特征类似,并且SNP的MAF均大于10%。而rs2276466不符合Hardy-Weinberg平衡遗传平衡定律（P=0.02）。2.分析发现BIRC5 rs3212986与GG基因型比较,TT基因型和T等位基因肝癌发病风险略微增高(95%CIs 为 1.93（0.96-3.94）与 1.49（0.95-2.13）,BIRC5 rs11615 TT和T等位基因肝癌发病风险增高(95%CIs为1.59（0.96-2.98）和1.42（0.97-2.26）。3.BIRC5的rs2276466和rs6498486与肝癌发病风险无相关性。4.提取志愿者的肝癌及癌旁组织,结果显示,癌旁组织中niR-218的表达明显较高,而BIRC5的表达较低。与癌旁组织相比,miR-218的表达在不同分期肝癌组织中均明显下降,而BIRC5的表达则均明显上升,且分期越晚,癌组织中的miR-218及BIRC5与癌旁组织的表达差异越大。5.双荧光素酶实验的结果显示,当HepG2细胞转染了克隆有BIRC5 3’-UTR载体质粒后,miR-218过表达组荧光素酶活性明显受到抑制,与对照组相比较差异明显。而转染克隆有BIRC5 3’-UTR突变型载体质粒后,miR-218组荧光素酶的活性值之间无明显差异。同时,BIRC5的蛋白表达水平也通过Western blot进行检测。结果显示,与空白对照组相比,BIRC5在miR-218过表达组的表达明显降低,在miR-218 inhibitor组的表达明显升高,而miR-218 overexpression NC及miR-218 interference NC之间的BIRC5含量差异无统计学意义,因此证明了BIRC5与miR-218之间的靶标关系。6.HepG2组中肉眼可见明显克隆集落,克隆形成率为59±5.568%。与对照组相比,miR-218过表达时克隆集落数量明显减少,克隆形成率为47.67±4.163%,而miR-218 inhibitor组中克隆集落明显增多,克隆形成率为76.67±4.726%。由此可知,靶向BIRC5的miR-218抑制了 HepG2细胞的克隆形成能力（p=0.0038）。7.Transwell小室实验中,对照组中可见一定数量的侵袭及转移细胞,与对照组相比,转染miR-218 mimic的细胞的侵袭及转移均受到了明显的抑制,二者的差异具有统计学意义（p=0.0032）。8.转染 miR-218 mimic 后抑制细胞 EMT 的转化,Vimentin、β-catenin、N-cadherin的表达下调,而E-cadherin的表达上调。与此同时miR-218 inhibitor组,由于干扰了 miR-218在细胞中的表达,Vimentin、β-catenin、N-cadherin的表达上调,E-cadherin的表达上调。（p<0.05）9.采用CCK8实验检测各转染组细胞的增殖情况。与microRNA对照组相比,转染针对BIRC5的miR-218组的细胞的生长受到了明显的抑制,二者的差异具有统计学意义（p=0.0002）。10.采用流式细胞仪验证HepG2细胞凋亡,以此探讨靶向BIRC5的miR-218是否可以诱导了 HepG2细胞的凋亡。对照组中HepG2细胞凋亡比率为9.64±0.59%,miR-218mimic组的细胞凋亡数明显增加,其比例达到20.52±0.58%。同时,miR-218 inhibitor处理组中细胞凋亡减少至5.6±0.63%,相比对照组,miR-218 inhibitor处理组中细胞凋亡明显减少。同时,通过免疫荧光染色检测了细胞凋亡相关因子caspase3及caspase6的表达,与对照相比,靶向BIRC5的miR-218 caspase-3及caspase6的表达明显上升。11.与HepG2组相比,miR-218过表达后G1期比例明显上升,S期细胞显着下降,而miR-218 inhibitor组中G1期比例明显下降,S期细胞也有上升的趋势。（p=0.0101）。而G2期的比例变化无统计学意义。12.通过Western blot检测Wnt/β-catenin通路中沿路分子的蛋白表达。经检测发现,当miR-218过表达时,BIRC5表达下降,同时GSK-3β的磷酸化表达下降,TCF7、LEF1及β-catenin的表达均有明显下降（p=0.0023）,而Wnt3a,Dvl,GSK-3β的表达变化无统计学意义。13.在BALB/c-nu小鼠皮下成瘤实验8周后,可明显发现实验组（注射miR-218 mimic质粒转染后的HepG 2细胞株）所生成瘤体长径、短径、重量、体积均明显小于对照组（注射HepG 2细胞株）所生成的瘤体。进一步通过HE染色观察可发现,对照组肿瘤组织体积较大,有小片坏死区域,肿瘤细胞生长旺盛,细胞核异型性明显,间质血管丰富,而实验组的肿瘤切片坏死区域明显增大,间质血管稀少,可见明显纤维化形成,肿瘤细胞生长受到明显抑制。BIRC5的免疫组化证明,BIRC5表达于HepG2细胞质内,对照组中BIRC5表达较高,而miR-218 mimic质粒的转染明显抑制了 BIRC5的表达。14.肝癌细胞系中的miR-218能靶向BIRC5,高表达的miR-218通过下调BIRC5调节GSK-3β/β-catenin通路,抑制肝癌细胞株HepG2中EMT相关基因Vimentin、β-catenin及N-cadherin的表达并上调E-cadherin表达,抑制钙黏蛋白转换的过程,以此抑制了 EMT的发生。同时,高表达的miR-218通过下调BIRC5抑制HepG2细胞株增殖及克隆能力,并促进细胞的凋亡。结论:在中国人群中BIRC5 rs3212986和rs11615基因多态性与肝癌发病风险有相关性。rs2276466和rs6498486与肝癌发病风险无相关性。miR-218可能通过抑制BIRC5基因转录活性,并通过下调BIRC5调节GSK-3β/β-catenin通路,下调β-catenin表达,从而抑制HepG2细胞株的侵袭转移能力并抑制EMT的发生发展过程,抑制HepG2细胞株增殖及克隆能力,并促进细胞的凋亡,以此抑制肝癌的发生和发展。
王思源[8]（2019）在《体内实验研究凋亡抑制蛋白样蛋白2促进乳腺癌细胞生长》文中进行了进一步梳理凋亡抑制蛋白样蛋白2（Inhibitor of apoptosis protein-like protein-2,ILP-2）是凋亡抑制蛋白家族（Inhibitors of apoptosis proteins,IAPs）成员之一,基因位于人染色体（19q13.3-13.4）上,具有高度保守性,其编码产物能够抑制细胞的凋亡。我们项目组前期研究发现ILP-2在乳腺癌血清中含量较高,且能促进乳腺癌细胞的生长,提示ILP-2在乳腺癌的发生发展中具有重要的意义。本研究拟通过体内实验进一步探究ILP-2对乳腺肿瘤生长的影响及分子机制,为明确ILP-2可作为乳腺癌靶向治疗的分子靶及研发相应的抗癌药物提供实验依据。本研究利用慢病毒载体介导RNAi技术构建人源ILP-2干扰慢病毒载体,将其转入人乳腺癌细胞MCF-7中,用嘌呤霉素筛选得到敲低ILP-2表达的稳转株,且用免疫印迹法（Western Blot,WB）检测稳转株（MCF-7-Control、MCF-7-ILP-2-sh3、MCF-7-ILP-2-sh5）中ILP-2的表达,结果显示MCF-7-ILP-2-sh5稳转株的ILP-2蛋白表达显着降低,表明敲低ILP-2表达的MCF-7稳转株构建成功。采用CCK-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）法检测三组稳转株的生长活性,结果显示靶向敲低ILP-2表达的稳转株生长增殖速度明显减慢,说明ILP-2对乳腺癌细胞的生长具有促进作用。将MCF-7-ILP-2-sh5稳转株与对照稳转株（MCF-7-Control）移植于裸鼠皮下组织,结果显示干扰组的移植瘤体积明显较对照组小,表明敲低ILP-2的表达能有效地抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长。采用Western Blot、实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-time PCR,RT Q-PCR）、免疫组化进一步探讨ILP-2促进乳腺肿瘤生长的作用机制,结果显示,下调ILP-2不影响Chk2的表达,但上调p-Chk2和Caspase-3,说明ILP-2促进乳腺肿瘤生长与Chk2调控的信号通路相关。
王静林[9]（2019）在《香菇多糖对人HT-29结肠癌的非免疫途径抗肿瘤作用及机制研究》文中认为香菇（Lentinus edodes）是着名的药食两用菌,既味道鲜美、营养丰富,又具有多种药理活性。香菇多糖（Lentinan）是从香菇子实体中提取得到的最有效生物活性成分,作为一种典型的β-（1-3）-D-葡聚糖,它具有降血糖、降胆固醇、抗病毒、免疫调节及抗肿瘤等多种药理活性。早在1980年代香菇多糖既作为抗癌药物上市,在临床上作为免疫增强剂用于癌症的辅助治疗。然而,其抗肿瘤作用的分子机制尚不明确,在一定程度上限制了其临床应用。目前普遍认为香菇多糖仅能通过激活免疫系统发挥间接抗肿瘤作用,而不能直接杀伤肿瘤细胞;且主要表现为T淋巴细胞免疫系统依赖。然而,本课题组在前期研究中发现,香菇多糖能显着抑制多种肿瘤细胞的体外增殖,即发挥了非免疫途径的抗肿瘤作用。因此,本论文旨在探究香菇多糖是否具有非免疫途径的直接抗肿瘤作用及其内在分子机制,为拓宽香菇多糖的临床应用、充分发挥其药用价值及开发肿瘤治疗新制剂提供理论及实验基础。本论文以房县小香菇子实体为原料,沿用课题组已建立的工艺,提取、分离、纯化得到精制香菇多糖（SLNT）并通过一系列手段进行质量评价。通过体外实验探究了香菇多糖对人结肠癌HT-29细胞的非免疫途径抗肿瘤作用;并建立T细胞缺陷的HT-29荷瘤裸鼠模型及T、B、NK细胞缺陷且巨噬细胞及补体系统等受损的HT-29荷瘤联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠模型,探讨香菇多糖能否在不同程度免疫系统缺陷的小鼠体内发挥其非免疫途径的直接抗肿瘤活性;并着重从Ⅰ型程序性死亡（细胞凋亡）及Ⅱ型程序性死亡（自噬性细胞死亡）两个角度探索了其可能的分子机制。本课题研究不仅补充了香菇多糖抗肿瘤分子机制的理论基础,且有助于其作为功能性食品及抗肿瘤临床用药的开发应用。第一部分香菇多糖SLNT的制备香菇多糖的制备沿用本课题组已建立并优化的工艺技术:采用水提醇沉法从房县小香菇子实体中提取香菇粗多糖,再经H2O2脱色法除去色素及部分杂质得到脱色后多糖,最后通过超滤法分离纯化得到精制香菇多糖,经冷冻干燥后为白色絮状物,性状稳定。对提取的香菇多糖进行纯度及分子量鉴定:苯酚‐硫酸法检测精制香菇多糖的糖含量约为98.54%;高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测得精制香菇多糖的重均分子量约为6.23×105 Da,且分子量均一;紫外扫描结果显示其几乎不含蛋白质和核酸。本部分实验结果表明,香菇多糖的提取工艺成熟可靠、易于控制、结果稳定;提取得到的精制香菇多糖（SLNT）分子量均一、纯度高、几乎不含其它杂质,满足后续实验要求。第二部分香菇多糖对人HT-29结肠癌体内外的非免疫途径抗肿瘤作用研究结肠癌是全球癌症致死数量排名第二的癌症,每年约有100多万新增病例和约50多万死亡病例。目前临床上主要通过手术切除病灶并通过化学疗法进行治疗。尽管化学治疗有助于缓解症状、延长病患的生命,但是其不可避免的副作用（如腹泻、恶心、呕吐、急性心肌梗死、脑血管伤害等）极大地降低了病患的生活质量,严重的甚至可能威胁生命。因此,寻找筛选具有低毒、高效抗肿瘤活性的天然产物变得十分重要。本论文选用了来源为人结肠癌原发灶、属于TNMⅠ期结肠癌、在裸鼠及NOD/SCID小鼠体内成瘤性极好、且多种癌基因表达呈阳性的人结肠癌HT-29细胞系作为研究载体,探究了天然产物香菇多糖对人HT-29结肠癌体内外的非免疫途径直接抗肿瘤作用。通过MTT比色法考察了香菇多糖（SLNT）对人结肠癌HT-29细胞体外增殖的抑制作用。结果显示,将不同浓度香菇多糖（12.5-1600μg/mL）与HT-29细胞共培养48小时后,HT-29细胞的增殖均被显着抑制,且随着香菇多糖浓度增加,抑制率增加,具有一定剂量依赖性。当香菇多糖浓度为1600μg/mL时,抑制率达到66.84%,抗肿瘤作用显着,仅次于阳性对照组氟尿嘧啶（800μg/mL）的抑制率74.24%。通过光学显微镜观察细胞形态,发现香菇多糖组中大量细胞体积变小、贴壁不紧密、与周围细胞连接消失、细胞质浓缩;而正常细胞贴壁紧密,成团生长,细胞质未出现浓缩。建立T淋巴细胞缺陷的HT-29荷瘤裸鼠模型,探究香菇多糖是否能发挥T淋巴细胞免疫系统非依赖的抗肿瘤作用。采用皮下注射HT-29细胞植瘤建立荷瘤裸鼠模型,并随机分为阴性对照组（NC,注射等体积生理盐水）,阳性对照组（5-FU,20 mg/kg氟尿嘧啶）,香菇多糖低、中、高剂量组（0.2、1.0、5.0 mg/kg SLNT）;每组6只,采取尾静脉注射方式,隔天给药,共给药10次,同时记录裸鼠体重及肿瘤体积大小。实验结束后,对离体肿瘤组织及脾脏称重,计算脾指数、抑瘤率,并检测裸鼠血清中IL-6及TNF-α的水平。结果显示,香菇多糖各剂量组裸鼠体重在正常范围内,而氟尿嘧啶组体重严重低于正常水平;低、中、高剂量香菇多糖对HT-29荷瘤裸鼠移植瘤的抑制率分别为17.88%、48.87%和57.90%,具有一定剂量依赖性;氟尿嘧啶的抑制率为67.23%,表明香菇多糖能发挥T淋巴细胞免疫系统非依赖的抗肿瘤作用。且与阴性对照组相比,香菇多糖各剂量对裸鼠的脾指数及血清中IL-6的水平无明显影响,没有统计学差异,表明香菇多糖未提高其他免疫系统功能;而结果又显示,香菇多糖显着增加了血清中TNF-α的水平,我们猜测香菇多糖的抗肿瘤作用可能与肿瘤坏死因子有一定关联。为了进一步排除香菇多糖免疫调节作用对其直接抗肿瘤作用的影响,我们采用了T、B、NK细胞缺陷且巨噬细胞及补体系统等受损的联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠作为动物模型,并选用与裸鼠实验中相同的给药方式及剂量进行实验。随机分为阴性对照组（NC,注射等体积生理盐水）、香菇多糖低剂量组（1.0 mg/kg SLNT）及香菇多糖高剂量组（5.0 mg/kg SLNT）;每组5只,采取尾静脉注射,隔天给药,共给药10次,同时记录小鼠体重及肿瘤体积大小。实验结束后,计算脾指数、抑瘤率、评估香菇多糖的毒副作用,并检测NOD/SCID小鼠血清中IL-2、IL-12、IL-6、IFN-γ及TNF-α水平。结果显示,香菇多糖治疗对小鼠未产生毒副作用;香菇多糖（1 mg/kg and 5mg/kg）各剂量对HT-29荷瘤联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠移植瘤的生长均有明显抑制作用,抑瘤率分别为45.05%和50.61%;且香菇多糖给药未刺激小鼠脾指数及其血清中IL-2、IL-12、IL-6、IFN-γ水平的上调,证明香菇多糖在免疫系统功能缺失的情况下抑制了HT-29移植瘤的生长,即发挥了其非免疫途径的直接抗肿瘤作用。而与裸鼠实验结果相似的,香菇多糖高剂量组显着上调了小鼠血清中TNF-α的水平,提示TNF-α可能参与了香菇多糖的直接抗肿瘤作用。总而言之,本部分研究证实了香菇多糖对人结肠癌HT-29细胞发挥了非免疫途径的直接抗肿瘤作用,且其抑瘤效果显着。并且通过两种免疫缺陷动物模型,证实了香菇多糖同样能在体内实验中发挥其T淋巴细胞免疫系统非依赖性的,甚至免疫系统非依赖的直接抗肿瘤作用。为后文香菇多糖非免疫途径抗肿瘤作用的分子机制研究奠定了基础。第三部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞凋亡作用的研究由于细胞凋亡（Ⅰ型程序性死亡）被公认为是最主要的导致细胞死亡的分子机制,于是本部分我们通过多种手段及技术探究了香菇多糖是否能诱导HT-29细胞凋亡而发挥其直接抗肿瘤活性。首先,通过流式细胞仪检测发现400、800、1600μg/mL SLNT与HT-29细胞共培养48小时后,HT-29细胞的凋亡率分别达到20.26%、31.80%、48.50%,均明显高于阴性对照组（NC,7.31%）,且具有一定剂量依赖性。为了进一步验证其结果,我们通过DAPI染色法、AO/EB及Annexin V-FITC/PI双荧光染色法观察了SLNT对HT-29细胞凋亡形态学的影响。DAPI染色法可见SLNT组细胞出现不同程度的核固缩（呈致密浓染蓝色荧光）及核碎裂,可见半球状、新月牙状细胞核,呈典型凋亡细胞核形态,而NC组细胞核完整,染色均匀一致;AO/EB染色法可见SLNT组细胞核被染成绿色、黄绿色或橘红色且呈固缩状或圆珠状,细胞核碎裂,而NC组细胞核结构完整,着绿色且均匀一致;Annexin V-FITC/PI染色可见SLNT组出现绿色或红色的早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞,且随着剂量增加,凋亡细胞增多。最后,我们检测了线粒体凋亡发生早期的标志性事件—线粒体膜电位下降。结果显示,香菇多糖显着降低了HT-29细胞线粒体膜电位。以上研究结果证明了香菇多糖能显着诱导HT-29细胞凋亡,从而发挥了其直接抗肿瘤作用。随后,我们通过对裸鼠及NOD/SCID小鼠HT-29肿瘤组织进行H&E染色,初步考察了肿瘤组织中细胞凋亡的情况。形态学观察发现SLNT组肿瘤组织中可见散布凋亡细胞（细胞体积缩小,胞质致密、核固缩或碎裂等）,且随着剂量增加,凋亡区域面积加大,而NC组细胞排列紧密,细胞核完整呈圆形和椭圆形。表明在体内实验中,香菇多糖也可能诱导了细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用。总而言之,本部分研究证明了香菇多糖能显着诱导HT-29细胞凋亡,从而发挥了其非免疫途径的直接抗肿瘤作用,也为下一部分的机制研究奠定了基础。第四部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞凋亡的机制研究细胞凋亡主要由两种途径诱导:内源性途径（线粒体凋亡通路）和外源性途径（死亡受体凋亡通路）。由于上一部分结果发现香菇多糖显着降低了HT-29细胞线粒体膜电位,提示香菇多糖激活了线粒体凋亡通路。因此,我们首先通过免疫印迹实验及免疫组化实验检测了香菇多糖对HT-29细胞及肿瘤组织中线粒体凋亡通路相关蛋白的影响。结果发现,香菇多糖给药显着激活了凋亡效应酶Caspase-3及凋亡起始酶Caspase-9,并上调了胞浆中细胞色素C（Cytochrome c）的水平及Bax/Bcl-2的比值,表现为线粒体凋亡通路激活。随后,我们评估了线粒体凋亡通络上游刺激因子活性氧（ROS）的水平及其与凋亡的关系。流式细胞仪及荧光显微镜观测发现,香菇多糖显着升高了HT-29细胞中ROS的水平,且具有剂量依赖性;而经过活性氧抑制剂NAC预培养后,香菇多糖组的凋亡率由32.91±1.21%显着降低至21.49±1.62%(***p<0.001);且抑制活性氧上升后,香菇多糖诱导的胞浆中Cytochrome c及Bax/Bcl-2比值的上调被阻断了,上述结果表明活性氧的升高有利于香菇多糖诱导HT-29细胞线粒体凋亡。但同时结果显示,与NAC组相比（6.94±0.57%）,NAC+SLNT组的凋亡率（21.49±1.62%）仍显着增高,提示香菇多糖可能同时通过死亡受体途径诱导HT-29细胞凋亡。死亡受体凋亡通路可由肿瘤坏死因子受体（TNFR1）、凋亡相关因子（Fas）等与相应配体（TNF-α、FasL等）结合而诱导,从而激活下游凋亡起始酶Caspase-8,继而活化凋亡效应酶Caspase-3,引发细胞凋亡。我们运用多种方法（免疫印迹、免疫组化、免疫荧光法）检测了HT-29细胞及肿瘤组织中死亡受体凋亡通路相关蛋白的水平。结果发现,SLNT显着激活了凋亡效应酶Caspase-8并抑制了NF-κB的活化。结合第二部分实验结果,香菇多糖明显上调了裸鼠及NOD/SCID小鼠血清中TNF-α的水平,提示香菇多糖可能通过TNF-α/TNFR1途径诱导死亡受体凋亡。因此,我们进一步检测了HT-29细胞分泌TNF-α的水平。结果显示细胞经香菇多糖刺激后,其分泌的TNF-α水平显着增高,表明表明香菇多糖有可能通过TNF-α/TNFR1途径激活了死亡受体凋亡通路。前期结果已发现SLNT激活了HT-29细胞及肿瘤组织中的Caspase-3,但为了进一步验证SLNT诱导的HT-29细胞凋亡是否通过Caspase-3激活介导,我们使用Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO进行了实验。流式细胞仪结果显示,经过Ac-DEVD-CHO预培养后,香菇多糖组的凋亡率由32.91±1.21%显着降低至15.88±1.58%(***p<0.001),表明香菇多糖诱导的HT-29细胞凋亡极大程度上通过Caspase-3激活介导。而抑制了Caspase-3的激活后,Ac-DEVD-CHO+SLNT组的凋亡率（15.88±1.58%）仍比Ac-DEVD-CHO组（7.77±0.79%）高,提示香菇多糖较小程度上可能通过非Caspase-3激活的途径介导细胞凋亡,有待进一步探究。本部分研究证明香菇多糖同时激活了线粒体及死亡受体凋亡通路,并因此诱导了HT-29细胞及肿瘤组织的凋亡。其分子机制总结如下图:（1）内源性线粒体途径—活性氧急剧增加,线粒体膜电位下降,Bax/Bcl-2比值增大促进细胞色素C由线粒体释放入胞浆,导致凋亡起始酶Caspase-9活化从而激活凋亡效应酶Caspase-3,诱导细胞凋亡。（2）死亡受体途径—上调TNF-α水平,激活TNF-α/TNFR1通路,抑制NF-κB炎症反应,从而活化凋亡起始酶Caspase-8,激活凋亡效应酶Caspase-3,诱导细胞凋亡。第五部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞自噬作用及初步机制研究自噬（Autophagy）即“自食（self-eating）”,是除细胞凋亡（apoptosis）即“自杀（self-killing）”以外的另一种细胞自我“毁灭”的过程。自噬性细胞死亡也被归Ⅱ型程序性死亡,也是导致细胞死亡的一种分子机制。因此,本部分我们进一步探讨了香菇多糖是否诱导HT-29细胞的自噬作用及其可能的分子机制。LC3是目前被广泛认可的自噬标志蛋白,常被用于自噬的监测。当自噬发生时,弥散性分布于细胞胞浆中的LC3-I会被修饰加工,形成LC3-II并定位于自噬体,从而指示自噬体生成。通过免疫印迹实验发现,与阴性对照组相比,香菇多糖组的HT-29细胞及肿瘤组织中LC3-II显着增加;且LC3免疫荧光实验结果显示,香菇多糖组细胞中绿色斑点（自噬体）较正常细胞明显增多,表明香菇多糖显着刺激了HT-29细胞内自噬体的形成。同时免疫印迹实验显示,香菇多糖显着刺激了自噬体形成关键蛋白Beclin 1的上调,再一次佐证了香菇多糖发挥了促进HT-29细胞自噬体形成的作用。而自噬体的增加并不一定意味着自噬作用增强,也有可能是由于自噬体与溶酶体融合受阻导致。因此,我们通过以下三个实验检测香菇多糖对HT-29细胞自噬流的影响:（1）检测自噬降解过程的标志蛋白p62,其含量降低表明自噬降解过程通畅;（2）mCherry-GFP-LC3B双荧光标记法,同时反映自噬体及自噬溶酶体的数量;（3）透射电镜观察自噬形态。上述实验结果显示,香菇多糖能促进HT-29细胞中自噬流增强,即激活了HT-29细胞自噬。通过免疫印迹实验检测细胞及肿瘤组织中自噬相关蛋白的含量,结果显示香菇多糖显着降低了p-mTOR、PI3K、p-AKT的含量,而显着增加了p-JNK及细胞中p-AMPK的含量。因此,推测香菇多糖可能通过以下途径诱导了HT-29细胞自噬:（1）抑制PI3K/Akt通路并激活了AMPK通路,共同直接或间接地抑制了下游自噬负调控蛋白mTOR的活性,激活自噬。（2）激活了JNK蛋白,促进其磷酸化Bcl-2/Bcl-XL,使自噬关键蛋白Beclin 1与其解离,激活自噬。总而言之,本部分研究证实了香菇多糖能显着诱导HT-29细胞自噬,并对其内在的分子机制做了初步的探索,更详细全面的机制研究有待进一步探索。第六部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞自噬对其直接抗肿瘤作用的影响自噬作用不同于凋亡作用（Ⅰ型细胞程序性死亡）,凋亡作用的最终结果是杀死细胞,而自噬作用对细胞生存的影响却具有双重性—既可保护又可杀伤肿瘤细胞。本部分研究承接第五部分,进一步探讨香菇多糖诱导的HT-29细胞自噬对其直接抗肿瘤作用的影响。我们选用了两种公认的自噬抑制剂3-甲基腺苷（3-MA）及氯喹（CQ）用于实验。MTT实验结果显示,自噬抑制剂氯喹及3-MA组对HT-29细胞的增殖基本无影响;而HT-29细胞经过CQ或3-MA预培养后,香菇多糖对HT-29细胞增殖的抑制率由56.04%（SLNT）分别显着降低至34.89%（SLNT+CQ）、37.63%（SLNT+3-MA）,表明香菇多糖诱导的自噬作用有助于其对HT-29细胞的直接抗肿瘤作用。为了进一步探究自噬激活对香菇多糖体内发挥直接抗肿瘤作用的影响,我们建立了自噬抑制的HT-29荷瘤NOD/SCID小鼠模型。采取皮下注射HT-29细胞植瘤,并随机分为阴性对照组（NC,注射等体积生理盐水）、自噬抑制剂氯喹组（5.0 mg/kg CQ）、香菇多糖组（5.0 mg/kg SLNT）、香菇多糖+氯喹组（5.0 mg/kg SLNT+5.0 mg/kg CQ）;每组5只,采取尾静脉注射,隔天给药,共给药10次,同时记录小鼠体重及肿瘤体积大小。实验结束后,对离体肿瘤组织称重,计算抑瘤率并评估氯喹用药的毒副作用。结果显示,香菇多糖组对移植瘤的抑制率为50.61%,而当其与氯喹联用时,抑瘤率显着降低（*p<0.05）至35.23%。本部分研究证明了香菇多糖诱导的自噬作用有助于其对HT-29细胞的直接杀伤作用,即表现为自噬性细胞死亡（Ⅱ型细胞程序性死亡）。总的来讲,香菇多糖能够通过激活人结肠癌HT-29细胞凋亡及自噬性死亡,而发挥其非免疫途径的直接抗肿瘤作用。本论文的研究为香菇多糖作为新型抗肿瘤药物应用于临床提供了充足的理论依据及实验基础。
袁飞[10]（2019）在《基于死亡受体通路的三联药物诱导HT29细胞凋亡的研究》文中提出TRAIL能诱导癌细胞凋亡而不伤害正常细胞,但遗憾的是目前大多数癌细胞都对其有抗性。本研究针对死亡受体（Death Receptor）信号通路的关键节点,采用三药联用的方法开展了新型肿瘤治疗方法的研究。本论文根据cFLIP靶点设计合成了多肽抑制剂（Peptide-H-1）,同时利用IG107（TRAIL替代抗体）及AT406开展了相关研究。主要以耐药性HT29细胞为实验材料。研究证明Rocaglamide、Peptide-H-1、IG107及AT406分别在01,600nM,01,600 nM,07?g/mL,03?g/mL的范围内单独用药72h内均不会引起HT29的凋亡。随后开展了两药联用的研究,结果发现AT406与Rocaglamide、Peptide-H-1和IG107两药联用能明显导致HT29的凋亡,在用药48h时,凋亡率分别为38、40和60%,而72 h时凋亡率则分别能达到52、51和72%。最后开展了三药联用的研究,研究发现三药联用后HT29细胞皱缩、变形严重,且大部分细胞裂解死亡;联合用药48h时凋亡率达到了6370%;而用药72h后,即使在最低浓度时也能达到4350%的凋亡率,而在最大浓度时凋亡率可达到7582%。同时,我们对联合用药导致HT29细胞凋亡的机制进行了研究,重点检测了HT29细胞凋亡信号通路中DR5受体、Caspase-8、c-FLIP、Caspase-3和Cleaved PARP的表达情况,结果显示这些蛋白的表达水平与联合用药的浓度间存在显着的量效依存关系,初步证明了三药联用确实是通过激活HT29细胞的凋亡信号通路,同时抑制了通路中的抗凋亡因子,从而使凋亡信号逐级传递,最终导致了HT29的凋亡。实验同时证明了三药联用48h时,正常细胞KMB17和MRC-5的形态正常,无明显的毒害作用。本研究证明了基于死亡受体信号通路的三药联用能显着引起耐药性的HT29肿瘤细胞的凋亡,且对正常细胞无细胞毒性,为今后开展动物实验和相关临床研究提供了良好的理论和实践基础。
二、凋亡抑制蛋白(IAPs)与恶性肿瘤（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、凋亡抑制蛋白(IAPs)与恶性肿瘤（论文提纲范文）
（1）Betatrophin通过调控ISL-1促进成体胰岛β细胞增殖的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 具有泛素连接酶活性的凋亡抑制蛋白影响恶性肿瘤的发生与发展 |
| 参考文献（References) |
| 硕士期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）PEITC调控结肠癌凋亡的机制研究及安全性评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 结直肠癌 |
| 1.2 结直肠癌的发生发展 |
| 1.3 细胞凋亡通路及其调控机制 |
| 1.4 异硫氰酸苯乙酯(PEITC)在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.5 立项依据与研究内容 |
| 第二章 PEITC对结肠癌发展的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 细胞株 |
| 2.2.3 主要实验试剂 |
| 2.3 主要实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养及传代 |
| 2.3.2 MTT检测细胞增殖 |
| 2.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.4 克隆形成实验 |
| 2.3.5 细胞划痕实验 |
| 2.3.6 Transwell侵袭实验 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 PEITC抑制结肠癌细胞增殖 |
| 2.4.2 PEITC诱导结肠癌细胞凋亡 |
| 2.4.3 PEITC抑制结肠癌细胞集落形成 |
| 2.4.4 PEITC抑制结肠癌细胞的迁移 |
| 2.4.5 PEITC抑制结肠癌细胞的侵袭 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 PEITC通过线粒体途径诱导结肠癌细胞凋亡 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 主要实验仪器 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 q-PCR |
| 3.3.3 Western blot |
| 3.3.4 OPA1多聚物和可溶性OPA1检测 |
| 3.3.5 用JC-1染色检测线粒体内膜膜电位 |
| 3.3.6 荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧 |
| 3.3.7 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 PEITC促进结肠癌细胞Caspase-3和Caspase-9蛋白的活化 |
| 3.4.2 PEITC抑制结肠癌细胞的OPA1多聚物的形成,增加可溶性OPA1表达 |
| 3.4.3 PEITC下调结肠癌细胞的线粒体内膜膜电势 |
| 3.4.4 PEITC上调结肠癌细胞内活性氧(ROS)水平 |
| 3.4.5 PEITC促进结肠癌细胞的BAX/BCL-2比值 |
| 3.4.6 PEITC促进结肠癌细胞H2A.X磷酸化 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 PEITC通过SMAC/Survivin信号通路调控结肠癌细胞凋亡 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 主要实验仪器 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 SiRNA处理细胞 |
| 4.3.3 细胞质组分分离 |
| 4.3.4 Western blot |
| 4.3.5 流式检测细胞凋亡 |
| 4.3.6 免疫共沉淀 |
| 4.3.7 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 PEITC促进结肠癌细胞SMAC和Cyto-c的表达 |
| 4.4.2 PEITC通过SMAC诱导结肠癌细胞凋亡 |
| 4.4.3 PEITC诱导结肠癌细胞SMAC与Survivin结合 |
| 4.4.4 PEITC促进结肠癌细胞ERK和JNK蛋白的磷酸化 |
| 4.4.5 PEITC通过ERK和JNK通路促进凋亡相关蛋白表达 |
| 4.4.6 PEITC通过ERK和JNK通路促进细胞凋亡 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 利用结肠癌裸鼠成瘤模型评价PEITC的抑癌效果及安全性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器与材料 |
| 5.2.1 主要实验仪器 |
| 5.2.2 主要实验试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 SPF级动物饲养 |
| 5.3.3 裸鼠皮下成瘤模型的建立 |
| 5.3.4 实时定量PCR检测mRNA表达 |
| 5.3.5 Western blot检测蛋白表达 |
| 5.3.6 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 PEITC抑制结肠癌肿瘤的生长 |
| 5.4.2 PEITC促进结裸鼠结肠癌肿瘤中线粒体途径凋亡相关蛋白Caspase-9、SMAC,抑制Survivin蛋白表达 |
| 5.4.3 PEITC对裸鼠血常规三系细胞数量无影响 |
| 5.4.4 PEITC对裸鼠肝肾功能无影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 讨论和结论 |
| 6.1 讨论 |
| 6.2 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 异硫氰酸苯乙酯抗肿瘤凋亡机制 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其它研究成果 |
| 致谢 |
（3）具有泛素连接酶活性的凋亡抑制蛋白影响恶性肿瘤的发生与发展（论文提纲范文）
| 1 凋亡抑制蛋白家族的基本结构 |
| 2 凋亡抑制蛋白在恶性肿瘤中的功能 |
| 2.1 IAPs调控细胞凋亡 |
| 2.2 IAPs调控炎症及免疫反应 |
| 2.3 IAPs调控细胞迁移 |
| 3 凋亡抑制蛋白与恶性肿瘤发生发展及预后的相关性 |
| 3.1 IAPs与恶性肿瘤的发生及不良预后正相关 |
| 3.2 IAPs与恶性肿瘤的发生及不良预后负相关 |
| 4 凋亡抑制蛋白与恶性肿瘤的治疗 |
| 5 问题与展望 |
（4）新型放疗增敏多肽ANTP-SmacN7对肺癌细胞的辐射增敏作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的 |
| 研究方法 |
| 第一部分 ANTP-SmacN7 融合多肽进入细胞状况观察 |
| 背景及目的 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 主要试剂、耗材 |
| 1.1.3 主要试剂缓冲液的配制 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 研究方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 ANTP-SmacN7 融合多肽的合成 |
| 1.2.2 ANTP-SmacN7 融合多肽进入肺癌 A549 细胞 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 ANTP-SmacN7 融合多肽对A549 细胞辐射增敏作用 |
| 2.1 对象与方法 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 主要试剂、耗材 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 ANTP-SmacN7 对肺癌A549 细胞的辐射增敏作用 |
| 2.4.2 ANTP-SmacN7 融合多肽的促凋亡作用 |
| 2.4.3 彗星实验检测ANTP-SmacN7 融合多肽促进辐射诱导的A549 细胞DNA损伤 |
| 2.4.4 Western blot检测不同实验组A549细胞的caspase、PARP等蛋白表达 |
| 2.4.5 加入Caspase抑制剂z-VAD后融合肽对A549 细胞辐射增敏作用减弱 |
| 2.4.6 泛caspase抑制剂z-VAD对 A549 细胞DNA双链断裂的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三部分 肺癌A549和H460细胞辐射敏感性比较及潜在机制分析 |
| 3.1 研究对象和方法 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 实验主要试剂、耗材 |
| 3.1.3 克隆形成实验比较肺癌A549和H460细胞辐射敏感性差异 |
| 3.1.4 免疫印迹(Western Blot)检测肺癌 A549 和 H460 两种肺癌细胞 Smac,XIAP,cIAP1,cIAP2 蛋白表达 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 Smac拮抗IAPs促肿瘤细胞凋亡作用研究 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）BV6联合顺铂及mTOR对卵巢癌化疗增敏作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 对象和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.研究对象 |
| 3.研究目的 |
| 4.研究方法 |
| 5.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.各实验组裸鼠用药后生长及生存情况 |
| 2.各实验组裸鼠用药后移植瘤体积变化情况 |
| 3.各治疗组抑瘤率情况 |
| 讨论 |
| 1.Smac及其与恶性肿瘤 |
| 2.mTOR及其与卵巢恶性肿瘤 |
| 3.本实验结果讨论 |
| 4 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 IAPs靶向药物Smac及其在卵巢癌中的研究现状 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）爱康方对人肺鳞癌SK-MES-1细胞内mTOR及相关凋亡蛋白影响的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词语表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 细胞株 |
| 1.3 实验主要试剂 |
| 1.4 实验主要仪器 |
| 1.5 药品 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 1.研究背景 |
| 1.1 现代医学对肺癌的认识 |
| 1.2 传统中医学对肺癌的认识 |
| 2.爱康方研究进展 |
| 2.1 爱康方组方分析 |
| 2.2 爱康方各药物的药理学研究 |
| 2.3 爱康方与环磷酰胺联合发挥抗癌作用 |
| 2.4 爱康方对人肺鳞癌SK-MES-1 细胞的研究进展 |
| 2.5 爱康方促进SK-MES-1 细胞凋亡并与环磷酰胺协同抗癌的机制讨论 |
| 3.小结 |
| 4.思考与展望 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 浅述中药对相关肿瘤细胞凋亡调节分子影响的研究进展 |
| 1.Caspases家族 |
| 1.1 Caspases家族概述 |
| 1.2 中药单体对caspases家族的影响研究 |
| 1.3 中药复方对caspases家族的影响研究 |
| 2.Bcl-2 家族 |
| 2.1 Bcl-2 家族概述 |
| 2.2 中药单体对Bcl-2 家族的影响研究 |
| 2.3 中药复方对Bcl-2 家族的影响研究 |
| 3.IAPs家族 |
| 3.1 IAPs家族概述 |
| 3.2 中药单体对IAPs家族的影响研究 |
| 3.3 中药复方对IAPs家族的影响研究 |
| 4.p53 |
| 4.1 p53 概述 |
| 4.2 中药单体对p53 的影响研究 |
| 4.3 中药复方对p53 的影响研究 |
| 5.展望 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组 |
| 1、开题报告专家小组成员 |
| 2、中期考核组成员 |
| 3、学位论文答辩委员会成员 |
（7）BIRC5基因型在肝癌中的分布及miR-218靶向BIRC5对肝癌细胞侵袭能力影响的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文部分 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 BIRC5的基因型分布与肝癌发病率的相关性 |
| 第1章 材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 实验方法 |
| 3 Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果 |
| 4 统计学分析 |
| 第2章 实验结果 |
| 1 研究对象的基本特征 |
| 2 BIRC5各种SNP基因型特征 |
| 3 BIRC5各种SNP基因型与肝癌发病风险 |
| 第二部分 MIR-218在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞侵袭能力的影响 |
| 第1章 材料与方法 |
| 1 细胞培养 |
| 2 RT-PCR验证miR-218在不同肝癌细胞株中的表达 |
| 3 质粒转染 |
| 4 Western blot检测 |
| 5 CCK8实验检测细胞增殖水平 |
| 6 Transwell迁移实验 |
| 7 克隆形成实验 |
| 8 流式凋亡检测方法 |
| 9 免疫荧光 |
| 10 双荧光素酶实验 |
| 11 细胞周期检测 |
| 12 裸鼠成瘤实验 |
| 13 HE染色 |
| 14 免疫组化染色 |
| 15 统计学处理 |
| 第2章 结果 |
| 1 四株肝癌细胞株中miR-218基因的表达情况 |
| 2 不同分期肝癌组织中miR-218及BIRC5的表达 |
| 3 质粒转染后miR-218的表达 |
| 4 BIRC5是miR-218的靶基因 |
| 5 靶向BIRC5的miR-218对HepG2细胞克隆能力的影响 |
| 6 靶向BIRC5的miR-218对HepG2细胞侵袭转移能力的影响 |
| 7 EMT相关标志物的蛋白水平检测 |
| 8 靶向BIRC5的miR-218对HepG2细胞增殖能力的影响 |
| 9 靶向BIRC5的miR-218的表达对肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 10 靶向BIRC5的miR-218对HepG2细胞周期的影响 |
| 11 miR-218通过下调BIRC5的表达调节GSK-3β/β-catenin通路 |
| 12 裸鼠成瘤实验 |
| 第三部分 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肝癌相关基因突变与肝癌遗传易感性的研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间所得的科研成果 |
| 学位论文及答辩辩情况表 |
| 附件 |
| 英文部分(大论文英文版) |
| Abstract |
| Chinese and English abbreviations table |
| Before the speech |
| The first part is the correlation between the genotype distribution of BIRC5 andthe incidence of liver cancer |
| Chapter 1 Materials and methods |
| 1 Research object |
| 2 experimental methods |
| 3 Hardy-Weinberg genetic balance test results |
| 4 statistical analysis |
| Chapter 2 The experimental results |
| 1 Basic characteristics of the research object |
| 2 Various SNP genotypes of BIRC5 |
| 3 Various SNP genotypes of BIRC5 and the risk of liver cancer |
| The two part expression of mir-218 in hepatocellular carcinoma cells and its effect on invasion ability of hepatocellular carcinoma cells |
| Chapter 1 Materials and methods |
| 1 Cell culture |
| 2 Rt-pcr confirmed the expression of mir-218 in different liver cancer cell lines |
| 3 Plasmid transfection |
| 4 Western blot test |
| 5 CCK8 assay was used to detect cell proliferation |
| 6 Transwell migration experiment |
| 7 Clone formation experiment |
| 8 Flow detection of apoptosis |
| 9 Immunofluorescence |
| 10 Double luciferase experiment |
| 11 Cell cycle detection |
| 12 Tumor formation in nude mice |
| 13 HE dyed |
| 14 Statistical processing |
| Chapter 2 Bear fruit |
| 1 Expression of mir-218 gene in four hepatocellular carcinoma cell lines |
| 2 Expression of mir-218 and BIRC5 in liver cancer tissues of different stages |
| 3 Expression of mir-218 after transfection with plasmid |
| 4 BIRC5 is the target gene of mir-218 |
| 5 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on the cloning ability of HepG2 cells |
| 6 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on invasion and metastasis of HepG2 cells |
| 7 Detection of protein level of EMT related markers |
| 8 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on proliferation of HepG2 cells |
| 9 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on apoptosis of tumor cells |
| 10 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on HepG2 cell cycle |
| 11 Mir-218 regulates gsk-3 beta/beta-catenin pathway by down-regulating BIRC5expression |
| 12 Tumor formation in nude mice |
| The three part Discussion |
| Conclusion |
| Reference |
| Literature Review Study on the genetic susceptibility of hepatocellular carcinoma to hepatocellular carcinoma |
| Reference |
（8）体内实验研究凋亡抑制蛋白样蛋白2促进乳腺癌细胞生长（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 ILP-2 的发现 |
| 1.2 ILP-2 蛋白结构 |
| 1.3 ILP-2 抗细胞凋亡作用 |
| 1.4 ILP-2 在肿瘤中表达的相关研究 |
| 1.5 慢病毒载体介导的RNAi |
| 1.6 裸鼠荷瘤实验 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 1.8 特色与创新之处 |
| 第2章 人源ILP-2 干扰慢病毒构建及验证 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株、菌株、质粒 |
| 2.1.2 主要实验仪器设备 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 构建人源ILP-2 干扰慢病毒载体 |
| 2.2.2 ILP-2-shRNA干扰慢病毒及对照载体包装 |
| 2.2.3 构建MCF-7-ILP-2-shRNA稳转细胞株及对照细胞株 |
| 2.2.4 蛋白样品制备 |
| 2.2.5 Western Blot检测稳转株的干扰效率 |
| 2.2.6 CCK-8 法检测稳转株细胞活力和生长能力 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组质粒酶切鉴定 |
| 2.3.2 慢病毒包装鉴定 |
| 2.3.3 慢病毒感染MCF-7 细胞 |
| 2.3.4 Western Blot检测稳转株干扰效率 |
| 2.3.5 CCK-8 检测稳转株的生长活性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 慢病毒介导的RNAi |
| 2.4.2 ILP-2 促进MCF-7 细胞的增殖 |
| 第3章 敲低ILP-2 表达对乳腺癌裸鼠皮下移植瘤增殖和凋亡的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞株、裸鼠 |
| 3.1.2 主要实验仪器设备 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 裸鼠荷瘤 |
| 3.2.3 RT Q- PCR检测各组织中相关基因mRNA水平的变化 |
| 3.2.4 Western Blot检测肿瘤组织中蛋白质的表达 |
| 3.2.5 免疫组化检测肿瘤组织中蛋白表达情况 |
| 3.2.6 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ILP-2 促进肿瘤组织的生长 |
| 3.3.2 下调ILP-2 不影响Chk2 的基因表达 |
| 3.3.3 干扰ILP-2 表达后促进p-Chk2及Caspase-3 蛋白表达 |
| 3.3.4 干扰ILP-2 表达导致组织中Caspase-3 表达升高 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 ILP-2 促进乳腺癌肿瘤生长 |
| 3.4.2 ILP-2 激活Chk2 作用促进乳腺癌肿瘤生长 |
| 第4章 总结和展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 附录 A 专有名词中英文对照表 |
（9）香菇多糖对人HT-29结肠癌的非免疫途径抗肿瘤作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 香菇多糖SLNT的制备 |
| 1.香菇多糖SLNT的提取、分离、纯化 |
| 2.香菇多糖SLNT的纯度及分子量测定 |
| 3.结果与讨论 |
| 第二部分 香菇多糖对人HT-29 结肠癌体内外的非免疫途径抗肿瘤作用研究 |
| 1.香菇多糖对HT-29 细胞体外增殖的抑制作用 |
| 2.香菇多糖对HT-29 荷瘤免疫缺陷裸鼠移植瘤生长的抑制作用 |
| 3.香菇多糖对HT-29 荷瘤联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠移植瘤生长的抑制作用 |
| 4.结果与讨论 |
| 第三部分 香菇多糖体内外诱导人HT-29 结肠癌细胞凋亡作用 |
| 1.香菇多糖体外诱导HT-29 细胞凋亡作用的研究 |
| 2.香菇多糖体内诱导HT-29 细胞凋亡作用的研究 |
| 3.结果与讨论 |
| 第四部分 香菇多糖诱导HT-29 细胞凋亡的机制研究 |
| 1.香菇多糖对HT-29 细胞及肿瘤组织中线粒体凋亡通路相关蛋白的影响 |
| 2.活性氧对香菇多糖诱导HT-29 细胞线粒体凋亡的影响 |
| 3.香菇多糖对HT-29 细胞及肿瘤组织中死亡受体凋亡通路相关蛋白的影响 |
| 4.Caspase-3 在香菇多糖诱导HT-29 细胞凋亡中发挥的作用 |
| 5.结果与讨论 |
| 第五部分 香菇多糖诱导人HT-29 结肠癌细胞自噬作用及初步机制研究 |
| 1.香菇多糖体外诱导HT-29 细胞自噬作用的研究 |
| 2.香菇多糖体内诱导HT-29 细胞自噬作用的研究 |
| 3.香菇多糖诱导HT-29 细胞自噬的初步机制研究 |
| 4.结果与讨论 |
| 第六部分 香菇多糖诱导人HT-29 结肠癌细胞自噬对其直接抗肿瘤作用的影响 |
| 1.MTT法检测体外香菇多糖诱导自噬对其直接抗肿瘤作用的影响 |
| 2.建立自噬抑制HT-29 荷瘤NOD/SCID小鼠模型观察香菇多糖体内诱导自噬对其直接抗肿瘤作用的影响 |
| 3.结果与讨论 |
| 研究总结 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 中英文缩略词对照表 |
| 附录2 攻读学位期间发表论文目录 |
| 附录3 实验动物合格证 |
（10）基于死亡受体通路的三联药物诱导HT29细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 TRAIL诱导的死亡受体通路 |
| 1.2 死亡受体通路中的抗凋亡因子 |
| 1.2.1 抗凋亡因子c-FLIP |
| 1.2.2 抗凋亡因子Bcl-2家族 |
| 1.2.3 抗凋亡因子IAPs |
| 1.3 靶向凋亡信号通路的肿瘤治疗 |
| 1.3.1 靶向死亡受体的药物 |
| 1.3.2 靶向抗凋亡因子c-FLIP的药物 |
| 1.3.3 靶向抗凋亡Bcl-2家族的药物 |
| 1.3.4 靶向抗凋亡IAPs家族的药物 |
| 1.4 TRAIL受体激动剂的安全性和药物抗性 |
| 1.5 多靶点联合用药 |
| 1.5.1 Rocaglamide和TRAIL两药联合用药 |
| 1.5.2 AT406和TRAIL两药联合用药 |
| 1.5.3 AT406、Rocaglamide和TRAIL三重组合联合用药 |
| 1.5.4 AT406、Peptide-H-1和IG107三重组合联合用药 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 铺板条件的优化及抗性细胞系筛选 |
| 2.1 主要设备信息 |
| 2.2 试剂和材料 |
| 2.3 主要溶液配制 |
| 2.4 方法 |
| 2.4.1 细胞冻存 |
| 2.4.2 细胞复苏 |
| 2.4.3 细胞传代 |
| 2.4.4 细胞铺板 |
| 2.4.5 药物处理细胞 |
| 2.4.6 MTT法测细胞相对活力 |
| 2.5 铺板条件、加药浓度和时间的优化 |
| 2.6 数据处理 |
| 2.7 结果 |
| 2.7.1 铺板条件优化的结果 |
| 2.7.2 抗性细胞筛选的结果 |
| 2.7.3 联合用药浓度的优化 |
| 2.8 小结与讨论 |
| 第三章 联合用药诱导HT29细胞凋亡的研究 |
| 3.1 主要仪器信息 |
| 3.2 试剂与材料 |
| 3.3 主要溶液配制 |
| 3.4 方法 |
| 3.4.1 细胞传代与铺板 |
| 3.4.2 药物处理细胞 |
| 3.4.3 MTT法测细胞相对活力 |
| 3.4.4 数据处理 |
| 3.5 联合用药对HT29细胞凋亡的结果 |
| 3.5.1 两药联用凋亡结果 |
| 3.5.2 三药联用凋亡结果 |
| 3.6 三药联用对正常细胞的效果评价结果 |
| 3.6.1 三药联用对KMB17细胞的效果评价结果 |
| 3.6.2 三药联用对MRC-5细胞的效果评价结果 |
| 3.7 小结与讨论 |
| 第四章 联合用药促HT29细胞凋亡机制研究 |
| 4.1 主要仪器信息 |
| 4.2 试剂和耗材 |
| 4.3 主要溶液配制 |
| 4.4 方法 |
| 4.4.1 细胞传代与铺板 |
| 4.4.2 药物处理HT29细胞 |
| 4.4.3 BCA试剂盒测蛋白浓度 |
| 4.4.4 蛋白免疫印迹实验 |
| 4.4.5 数据分析 |
| 4.5 结果 |
| 4.5.1 三药联用后DR5蛋白表达的结果 |
| 4.5.2 三药联用后Caspase-8蛋白表达的结果 |
| 4.5.3 三药联用后c-FLIP蛋白表达的结果 |
| 4.5.4 三药联用后Caspase-3蛋白表达的结果 |
| 4.5.5 三药联用后Cleaved PARP蛋白表达的结果 |
| 4.6 小结与讨论 |
| 第五章 总结及展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读硕士期间发表论文目录 |
四、凋亡抑制蛋白(IAPs)与恶性肿瘤（论文参考文献）
- [1]Betatrophin通过调控ISL-1促进成体胰岛β细胞增殖的研究[D]. 王舒婕. 昆明医科大学, 2021(02)
- [2]PEITC调控结肠癌凋亡的机制研究及安全性评估[D]. 黄莉. 南方医科大学, 2020(06)
- [3]具有泛素连接酶活性的凋亡抑制蛋白影响恶性肿瘤的发生与发展[J]. 王舒婕,刘文静,杨哲. 中国生物化学与分子生物学报, 2020(12)
- [4]新型放疗增敏多肽ANTP-SmacN7对肺癌细胞的辐射增敏作用及机制研究[D]. 张荣新. 天津医科大学, 2020(06)
- [5]BV6联合顺铂及mTOR对卵巢癌化疗增敏作用的研究[D]. 魏海玲. 天津医科大学, 2020(06)
- [6]爱康方对人肺鳞癌SK-MES-1细胞内mTOR及相关凋亡蛋白影响的机制研究[D]. 夏淑敏. 宁夏医科大学, 2020(08)
- [7]BIRC5基因型在肝癌中的分布及miR-218靶向BIRC5对肝癌细胞侵袭能力影响的分子机制研究[D]. 骆诤. 山东大学, 2019(03)
- [8]体内实验研究凋亡抑制蛋白样蛋白2促进乳腺癌细胞生长[D]. 王思源. 吉首大学, 2019(02)
- [9]香菇多糖对人HT-29结肠癌的非免疫途径抗肿瘤作用及机制研究[D]. 王静林. 华中科技大学, 2019(03)
- [10]基于死亡受体通路的三联药物诱导HT29细胞凋亡的研究[D]. 袁飞. 昆明理工大学, 2019(01)