一、嵌合体动物技术研究进展（论文文献综述）
刘朝,左雨萌,寇鑫淼,闫昊宇[1]（2021）在《纷纭旋转之间:新兴技术回应型立法的舆论引导——以胚胎嵌合体为例》文中指出胚胎嵌合体的实证研究显示,日本政府批准人-动物嵌合体实验的新动向引起全球的关注,而国内媒体面对这一有伦理争议的前沿生物技术新发展,相关报道在标题和正文中均缺乏必要的科学话语。这显然不利于引导全社会理性的思考和对话,影响人们对存在伦理争议的前沿科学实验的审慎观察,甚至可能使公众对此产生恐慌,加剧了促成社会多元共识的难度。这一现象也与已有的研究观点相悖,即媒体从以普法为核心的法制宣传期到与司法频繁互动的舆论监督期,参与了我国法治实践的方方面面。因此,舆论引导是迫切需要研究的问题。在回应型立法占据生物科技立法主导地位时,立法者、政策制定者和社会公众需要更多关注舆论导向的负面作用。如何实现媒体和生物新技术伦理法律的有效互动,是当前我国生物科技法律语境的一个需要迫切解决的难题。
刘默凝[2]（2021）在《乌骨绵羊诱导多能干细胞的建立》文中指出多能干细胞（Pluripotent stem cells,PSCs）在成年个体中具有向所有细胞类型分化的潜力,具有无限的自我更新能力。哺乳动物多能干细胞通常被分为三种类型:胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）、诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）和成体多能干细胞。诱导并建立乌骨绵羊iPSCs可为摸索绵羊ESCs体外培养条件奠定科学基础。在家畜中,只有猪获得了不依赖外源基因的iPSCs,牛、山羊、绵羊暂未见相关报道,对于家畜iPSCs的诱导还需进一步深入探索。本实验首先建立乌骨绵羊体细胞耳成纤维细胞系,使用不同转录因子体系对乌骨绵羊体细胞进行重编程,尝试获得具有强发育潜能或者定向发育潜能的绵羊iPSCs。随后对获得的乌骨绵羊iPSCs从细胞形态、核型、内源性多能基因表达、体内外三胚层分化能力以及发育潜能等方面进行研究,结果如下:（1）本实验通过组织块培养法从出生后15日龄的乌骨绵羊耳部皮肤成功分离雌、雄性两个乌骨绵羊成纤维细胞系,获得的细胞系核型正常（2n=54）、生长曲线符合正常细胞生长规律（S型）、无支原体污染,可作为诱导乌骨绵羊iPSCs的起始细胞系。（2）以piggyBac+Tet-on载体为基础设计并构建PB-TRE-sLargeT（SV40 Large T）、PB-TRE-hTERT和PB-TRE-sLhT（sLargeT和hTERT）三个表达载体,并通过电转染的方法整合至乌骨绵羊成纤维细胞基因组,在添加1.0μg/m L Doxycycline的条件下成功表达相应外源基因,证明三个载体可用于后续乌骨绵羊iPSCs的诱导。（3）X8（b OSMK+pNhL+sLhT）诱导体系、B9-LT（b OSMK+pNhL+hRL+sLargeT）诱导体系和10a（b OSMK+pNhL+hRL+sLhT）诱导体系均可诱导雄性乌骨绵羊成体细胞重编程,并且SV40 Large T可提高piggyBac+TET-on载体诱导的乌骨绵羊iPSCs重编程效率;本实验共建立了344个细胞克隆形态类似小鼠或人PSCs的乌骨绵羊iPSCs细胞系,其中X8诱导体系121个、B9-LT诱导体系134个、10a诱导体系89个;由X8诱导体系获得内源性OCT4激活程度最高的细胞系:X8-4,命名为:siPSC-4。（4）本实验建立的乌骨绵羊诱导多能干细胞系siPSC-4可稳定传代49代,核型正常（2n=54,31/40,77.5%）,内源性OCT4表达稳定,免疫荧光检测表达多能性基因OCT4、SOX2、NANOG和REX1,具有体外三胚层的分化能力并可在体内形成具有中、内胚层分化的畸胎瘤;此外,实验结果表明,STO饲养层细胞有助于siPSC-4内源基因OCT4的持续表达,在Feeder Free培养条件下,siPSC-4内源OCT4的表达量下降;另外小鼠和人类na（?）vePSCs的干细胞培养液2i、t2i、4i、5i以及小鼠拓展多功能干细胞（Expanded potential pluripotent stem cells,EPSCs）培养液不能维持siPSC-4的正常生长,最终细胞全部凋亡;（5）本实验建立的siPSC-4可参与小鼠和绵羊早期胚胎的发育,在15%（3/20）小鼠囊胚内细胞团（Inner cell mass,ICM）、26%（6/24）绵羊囊胚ICM中可检测到td-tomato标记的siPSC-4细胞;本研究首次使用piggyBac+TET-on转座系统表达外源转录因子（bovine OCT4、SOX2、KLF4、c MYC,porcine NANOG,human LIN28,SV40 Large T和human TERT）将雄性乌骨绵羊成体细胞重编程为诱导多能干细胞。获得表达多能基因、具备体外三胚层分化能力的乌骨绵羊iPSCs,为进一步研究绵羊全能胚胎干细胞的建系提供了优良的实验材料。
侯亚男[3]（2021）在《高亮度的单体化远红光与近红外藻胆蛋白荧光探针的研究》文中进行了进一步梳理生物组织有一个光学“透明窗口”,这个区域的光谱范围在650-900 nm之间,由于血红蛋白、水、脂质和黑色素等细胞成分在这个区域吸收最小,导致光对组织的穿透力更强,同时该区域还具有较低的自发背景荧光和光散射率,所以发射光谱处于这个区域的荧光蛋白特别适合深层组织成像。目前胆素蛋白已经将荧光蛋白的光谱范围扩展到远红光（FR,650-700 nm）和近红外（NIR,700-770 nm）区域。远红光和近红外区域的荧光蛋白对于生物成像和多重标记非常重要。然而,随着荧光蛋白发射波长的增加,荧光量子产率和荧光强度也会相应的降低,所以在保持近红外区域发射光谱红移的基础上,同时保证荧光蛋白的高亮度和单体状态依旧是个挑战。在远红光光适应的蓝藻中,我们发现了两个藻胆体核心亚基ApcE2和ApcF2,其中ApcE2来自于Synechococcus sp.PCC7335,ApcF2来自于Chroococcidiopsis thermalis sp.PCC7203。我们首先以ApcE2为模板,分子进化出一个可溶的藻胆蛋白,命名为北斗荧光蛋白BDFP3,它与植物光敏色素PФB非共价结合得到BDFP3.1,吸收峰在708 nm,荧光峰在720 nm。其中色素PФB是通过外部添加与BDFP3结合产生荧光的,游离色素PФB可通过先对BDFP3.3酸性尿素变性,再氯仿萃取的方式获得。随后我们将两个BDFP1.1与一个BDFP3进行融合,设计了一个三联嵌合体,命名为BDFP1.1:3.1:1.1,它的发射波长达722 nm,以单体形式存在,在哺乳动物细胞内的有效亮度是i RFP720的2.7倍。其中BDFP1.1是由ApcF2衍生而来,可以共价结合胆绿素BV,荧光峰在710 nm。本实验将BDFP1.1共价结合BV的荧光亮度和BDFP3非共价结合PФB的红移光谱有效结合,利用荧光共振能量转移（FRET）,将BDFP1.1-BV（作为供体）的能量传递给BDFP3.1（作为受体）,从而提高720 nm处的荧光亮度。同时将嵌合体BDFP1.1:3.1:1.1融合不同目的蛋白进行荧光标记,无论在原核细胞还是真核哺乳动物细胞中都能产生明亮的荧光。在BDFP1.1:3.1:1.1三联嵌合体的启发下,紧接着我们又设计了两个新的三联嵌合体,分别是BDFP1.2:3.3:1.2和BDFP1.6:3.3:1.6。它们的发射波长在670 nm,在哺乳动物细胞中表达时荧光亮度极高,而且以单体形式存在。BDFP3.3是由BDFP3非共价结合色素PEB得到的,它是一个明亮的红色荧光蛋白,吸收峰在608 nm,荧光峰在619 nm,且荧光量子产率可达到66%。因为哺乳动物细胞中只存在胆绿素BV,所以在动物细胞中表达时,色素PEB需要外部添加才能与BDFP3结合产生荧光。对于色素PEB的获取,可采用胰蛋白酶水解BDFP3.3的方式来替代色素PEB的萃取。BDFP1.2和BDFP1.6是由ApcF2衍生而来,可共价结合胆绿素BV。对于BDFP1.2:3.3:1.2来说,本实验将BDFP1.2共价结合BV的红移光谱和BDFP3非共价结合PEB的荧光亮度有效结合,利用荧光共振能量转移（FRET）,将BDFP3.3（作为供体）的能量传递给BDFP1.2-BV（作为受体）,从而提高670 nm处的荧光亮度。BDFP1.6:3.3:1.6的设计理念与之相同。BDFP3.3和BDFP1.2/1.6:3.3:1.2/1.6与目的蛋白融合进行荧光标记,可以进行很好的超分辨SIM成像。作为藻胆蛋白荧光探针,首次实现了红光与远红光的双色成像,同时利用嵌合方式增加细胞亮度的方法也为开发更多优良的荧光蛋白提供了新思路。BDFPs是由远红光诱导的蓝藻Chroococcidiopsis thermalis sp.PCC7203的别藻蓝蛋白β亚基ApcF2进化而来的,它们可以共价结合胆绿素BV产生远红光和近红外两种类型的荧光。其中远红光BDFPs的最大发射波长在670 nm,近红外BDFPs的最大发射波长为710 nm。BDFPs具有分子量小、可溶性高且光谱红移等优点,是开发出优良近红外荧光探针的理想模板。以N端缺失20-31aa的BDFP1.2为分子进化模板,我们获得了一个远红光荧光蛋白突变体并得到了解析。它的晶体结构显示一个BV发色团与Cys72和Cys82双共价结合。基于晶体结构,我们进一步优化了一系列新的单体化远红光和近红外荧光蛋白BDFPs,这些新开发的单体化BDFPs比之前报道的远红光和近红外单体荧光蛋白要亮得多,更适合作为荧光探针用于生物标记。
赵娜[4]（2021）在《丝氨酸蛋白酶抑制因子Spink7促进炎症消退的作用与机制探索 ——基于小鼠创面愈合与结肠炎模型的实验研究》文中提出炎症是免疫反应的重要组成部分,是机体针对病原体、组织损伤等刺激产生的重要病理生理反应,其目的是清除感染源、恢复组织稳态。为了既能达到良好清除效果又能避免对宿主的过度损伤,炎症反应的进程受到严格的调控。在炎症反应的初始阶段,组织原位的巨噬细胞侦测到损伤信号后被激活,并迅速在损伤部位募集中性粒细胞;继而大量单核细胞浸润,并在致炎微环境作用下分化成巨噬细胞。一经激活,这些巨噬细胞呈现促炎的经典激活表型（M1型）,分泌大量促炎细胞因子。随着炎症的发展,中性粒细胞吞噬病原体或坏死组织后发生凋亡,而巨噬细胞清除摄入死亡中性粒细胞后表型向抗炎、促修复的选择激活型（M2型）转化,进而形成有利于炎症消退的微环境,实现炎症部位细胞组织的稳态重建。炎症的消退,涉及到免疫细胞与微环境的复杂相互作用,其关键环节的失调常导致炎症消退障碍,是多种慢性炎症性伤病的重要原因。因此,深入研究炎症消退的细胞、分子机制,并探索新的调节策略,对于诸如慢性难愈创面、炎症性肠病等炎症消退障碍疾病的防治具有重要意义。丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK7（Serine Peptidase Inhibitor,Kazal Type 7）,又名ECRG2（Esophagus Cancer-Related Gene 2,食管癌相关基因2）,定位于人5号染色体（小鼠为18号染色体）,编码区域有258个碱基,翻译成含85个氨基酸的9.23k D大小的蛋白产物,可以分泌到胞外,在食管上皮、口腔粘膜等组织呈组成性高表达。最初通过基因差异表达筛选发现在食管癌组织表达显着降低。早期的研究发现,SPINK7可以通过胞外丝氨酸蛋白酶抑制剂活性和胞内非丝氨酸蛋白酶抑制剂活性两种途径发挥作用,调控细胞的增殖、凋亡、迁移与侵袭等重要表型,发挥抑癌基因的功能。最新的研究表明,SPINK7作为抑制性检查点分子调控食管上皮炎症反应,参与嗜酸性食管炎（Eosinophilic Esophagitis,Eo E）的发生发展。研究显示,相对于正常食管上皮,SPINK7在Eo E病人的食管组织表达显着降低达15倍之多;在正常食管上皮细胞敲降/敲除SPINK7可抑制上皮分化进而削弱其屏障功能,更重要的是其可通过抑制u PA/u PAR促进嗜酸性粒细胞的活化,靶向下调KLK5（Kallikrein 5）蛋白酶活性,抑制PAR-2（Rroteinase-activated receptor 2,PAR2）活化调控诸多趋化因子/细胞因子的表达,发挥炎症反应抑制性检查点的功能。但目前关于SPINK7作为抑制性检查点分子调控炎症反应的研究仅限于食管上皮,其作用是否有普遍意义,即在其他系统中炎症反应调节的功能,有待进一步深入研究。本研究分别在小鼠皮肤创伤愈合模型和实验性结肠炎模型对SPINK7调控炎症消退的作用进行了系统研究并初步探讨了其作用机制。在小鼠急性创面愈合实验中,利用组织学染色技术、免疫组化染色技术、q RT-PCR、组织RNA芯片、多重荧光酶联免疫检测、明胶酶活性检测、尿激酶活性检测等技术分析了Spink7缺失对创面愈合速率、再上皮化水平、炎性细胞浸润、促炎/趋化因子分泌水平、蛋白酶活性水平、巨噬细胞极化比例的影响,明确Spink7对创面愈合炎症反应消退的影响和作用;以PAR2抑制剂进行在体干预,评价抑制该通路对Spink7缺失导致的炎症消退障碍、愈合延迟等表型的影响;利用Raw264.7细胞,通过慢病毒稳定转染、细胞条件上清刺激培养、纯化蛋白刺激培养等方法提高Spink7水平观察对于LPS诱导的炎症反应的影响,对Spink7的抗炎机制进行初步探讨;并在由于炎症反应不足导致愈合延迟的放创复合伤小鼠模型,评价了创面原位si RNA敲降Spink7促进创面愈合的可行性。本部分所取得的主要实验结果和结论如下:1.小鼠皮肤创伤修复过程中Spink7在增殖期创面表达显着上调,创面局部采用Spink7特异性si RNAs抑制其表达,导致以再上皮化延迟、炎症消退障碍为特征的延迟愈合表型。2.以Spink7敲除小鼠为对象,发现Spink7敲除与si RNAs的敲降表现出类似的炎症消退障碍表型。进一步研究发现,Spink7敲除导致增殖期创面（伤后7 d）存在:炎症相关通路过度激活,促炎细胞因子IL-6,IL-1β和TNF-a和趋化因子KC、MIP-2和MIP-1a的分泌增多;u PA、MMP2/9等蛋白酶存在过度活化;巨噬细胞M2极化显着不足。3.以PAR2抑制剂进行在体干预,发现Spink7敲除导致的难愈表型不依赖于PAR2通路的激活。4.体外细胞实验表明,采用慢病毒稳定感染、条件上清作用、纯化蛋白刺激等上调巨噬细胞培养体系中Spink7蛋白水平的方法,均能够抑制LPS刺激导致的促炎细胞因子等基因的表达上调,并初步发现Spink7可以负调控LPS诱导的NF-κB和p38MAPK信号通路的激活。5.在小鼠放创复合伤的创面延迟愈合模型中,Spink7的表达水平较单纯急性创面显着上调,局部采用Spink7特异性si RNAs抑制其表达,可以调高放创复合伤创面炎症反应,促进其愈合。在小鼠实验性结肠炎模型,利用2%DSS诱导造模,通过组织学染色技术、免疫组化染色技术、q RT-PCR、Bio-Plex多重蛋白检测技术、激光共聚焦显微观察、骨髓移植嵌合体小鼠构建、生物信息学分析技术检测Spink7缺失对小鼠实验性结肠炎的溃疡症状的影响,初步明确该分子对实验性结肠炎炎症表型的调控作用。本部分所取得的主要研究结果和结论如下:1.Spink7在DSS诱导的实验性结肠炎模型中呈诱导性高表达。Spink7敲除小鼠对结肠炎损伤敏感性显着增高,表现为体重下降明显、结肠炎临床症状更严重、结肠长度更短、组织病理学评分更严重等;相应的一系列促炎细胞因子和趋化因子的表达、分泌较野生对照小鼠也显着增高。2.通过构建骨髓移植嵌合体小鼠,证明骨髓造血细胞来源的Spink7对实验性结肠炎发挥了主要保护作用。进一步通过多重免疫荧光标记实验,表明Spink7主要在实验性结肠炎组织的中性粒细胞中表达。3.通过免疫组化染色和公开数据库分析等方法,评估SPINK7在人炎症性肠病组织中的表达模式。发现SPINK7在人结肠组织上皮呈组成性表达,在人炎症性肠病存在表达下调的趋势。综上所述,本研究采用小鼠皮肤创面愈合模型和实验性结肠炎模型进行研究,结果表明Spink7作为炎症反应的抑制性检查点分子,是促进炎症消退的关键因子。在皮肤创面愈合模型,研究发现Spink7缺失导致炎症消退障碍为特征的难愈表型,初步的机制探讨排除其依赖PAR2激活导致该表型,体外细胞实验显示Spink7可通过抑制NF-κB等通路拮抗LPS诱导的巨噬细胞M1极化表型,而在放创复合伤创面干预敲降Spink7则可通过调高炎症反应促进创面愈合。在实验性结肠炎模型,研究表明Spink7缺失导致肠炎损伤程度加重,而中性粒细胞来源的Spink7发挥了主要的抗炎保护作用。这些结果丰富了对于炎症消退调控的细胞分子机制的理论认识,为探索对于诸如慢性难愈创面、炎症性肠病等炎症消退障碍疾病的防治策略提供了新靶点。
康宇[5]（2020）在《非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究》文中研究说明哺乳动物的胚胎早期发育开始于精子和卵子融合形成合子,之后经历卵裂、囊胚孵化、子宫定植等过程最终发育为完整个体。胚胎植入前发育的过程中会发生一系列重要的生物学事件,如母源——合子转化、合子基因激活、细胞谱系分化等。这些事件的有序发生均依赖于细胞内复杂的分子调控机制,并且极易受到环境应激因素的影响,如高温和内分泌干扰素都会干扰发育中的配子和胚胎正常发育,甚至产生可遗传的表观遗传变异。非人灵长类（NHPs）由于与人类极高的相似性,对其植入前胚胎发育机制的研究有助于解答人类早期胚胎发育的重要问题,同时,非人灵长类也是人类疾病研究的重要动物模型。本论文以猕猴和食蟹猴为对象,利用体外受精技术,开展植入前胚胎发育的转录调控机制和转化研究。研究通过收集猕猴植入前胚胎各个发育阶段的胚胎单细胞样本进行转录组测序,建立了完整的猕猴体外受精胚胎植入前发育转录组图谱。之后经过深入分析胚胎植入前发育过程的转录调控模式,发现灵长类早期胚胎发育中存在转录阻滞现象,桑葚胚时期的胚胎中有部分细胞的转录组停滞在合子基因激活之前阶段。在研究中还构建了体细胞核移植胚胎和单性生殖胚胎,这两类胚胎是研究合子基因组重编程机制及父源/母源印记基因调控的重要材料,通过获取这些胚胎的植入前发育单细胞转录组数据并与正常体外受精胚胎进行比较,发现体细胞核移植（SCNT）和单性生殖（孤雄/孤雌）胚胎的转录模式存在更为普遍的延迟,分析表明这种延迟主要是由异常的表观遗传修饰而导致的合子基因组激活不完全,胚胎发育率下降。通过外源手段消除体细胞核移植胚胎异常的H3K9me3,可以提高体细胞核移植胚胎发育率并且获得克隆动物。非人灵长类是研究人类疾病的理想动物模型。本论文利用CRISPR/Cas9技术进行了食蟹猴植入前胚胎的靶向基因编辑,获得DAX1基因突变猴模型。模型动物出现人类患者肾上腺发育不全（AHC）和低促性腺素性功能减退症（HH）的相关表型,经分析发现Wnt/β-catenin信号通路的异常激活导致的血管发生缺陷可能是DAX1基因突变胎儿时期肾上腺发育不良的主要原因。研究同时发现雄性食蟹猴DAX1缺陷导致的肾上腺和性腺发育缺陷在胎儿期性腺决定阶段就已经开始。通过食蟹猴植入前胚胎的干细胞嵌合实验,证明了非人灵长类胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（i PS）和体细胞核移植来源的胚胎干细胞（NT-ESC）都可以实现食蟹猴胚胎和成体水平嵌合,并且具有三胚层及胚外组织分化潜能。通过收集分析嵌合胚胎的单细胞转录组数据发现,食蟹猴多能干细胞的胚胎嵌合效率差异与其自身的多能性状态密切相关,并且受到嵌合胚胎微环境的调控。综上,本论文研究了非人灵长类胚胎早期发育的转录调控,并构建了疾病动物模型以及嵌合体,从而开展疾病机制和干细胞多能性研究。首次绘制了完整的灵长类植入前发育转录图谱,是对灵长类早期发育调控研究领域的重要补充;利用CRISPR/Cas9技术构建的疾病猴模型表现了其它物种不能出现的、与病人高度相似的表型,是人类复杂疾病研究的理想动物模型。
孙伟娟[6]（2020）在《杆状病毒AcMNPV与家蚕二分浓核病毒嵌合体病毒的构建及其特性分析》文中研究指明家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori bidensovirus,BmBDV）,隶属于二分DNA病毒科,二分浓核病毒属,其基因组含有两个大小分别为6.5 kb（VD1）和6 kb（VD2）的线性单链DNA节段。BmBDV特异性侵染家蚕中肠柱状上皮细胞,引发家蚕罹患类似昆虫浓核症,是蚕业经济减产的主要病原之一。目前还没有一种体外培养细胞系支持BmBDV感染,使得BmBDV的增殖与基因功能研究受到极大限制,病毒的入侵和复制机制、病毒的基因功能、病毒基因的表达调控机制能等方面还远未阐明,构建稳定高效的能拯救BmBDV的反向遗传体系尤为重要。通过克隆质粒对病毒进行拯救是一种有效策略,苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）的基因组可看做一大质粒,能够容纳约100 kb的外源DNA,在敏感细胞中高效复制。本研究拟利用Bac-to-Bac系统将BmBDV的基因组插入到AcMNPV中,构建AcMNPV与BmBDV嵌合体重组病毒,分析嵌合体病毒的复制特性。首先,我们在不破坏基因组完整性的情况下,分别在VD1编码蛋白NS1和VP的C-末端融合Flag标签,在VD2基因组非编码区内插入标记基因eGFP完整表达盒,通过酶切酶连接的方法成功构建了包含BmBDV基因组和标记基因的重组转座质粒:pVD1-NS1Flag、pVD1-VPFlag和pVD2-GFP。重组质粒转染Hi5细胞,WesternBlot能够检测到NS1,VP蛋白的表达,VD2重组质粒能够在Hi5细胞内表达荧光。其次,利用Bac-to-Bac系统成功构建包含VD1或VD2融合特异标记的嵌合体病毒Ac-VD1/NS1Flag,Ac-VD1/VPFlag和Ac-VD2GFP。RT-PCR和Western-Blot分析表明BmBDV基因能够随嵌合体病毒在昆虫细胞Hi5内进行转录和表达,基因表达模式与野生型病毒感染家蚕中肠相似。然后,我们用重组病毒单独感染或共感染Hi5细胞,感染96 h后收集细胞裂解液,喂食感性品系华八三五二龄家蚕幼虫,在添食病毒感染的细胞裂解液的家蚕中未观察到典型的BmBDV感染症状,在家蚕中肠中也没有观察到eGFP的表达;取家蚕中肠通过RT-PCR和Western Blot分子生物学技术分析也并未检测到BmBDV基因的复制和表达。这些结果表明,BmBDV没有随重组病毒在Hi5细胞中的复制而获得拯救。Southern Blot结果表明,在重组病毒感染的Hi5细胞中,BmBDV基因组不能从嵌合体病毒中得以拯救。综上所述,我们成功构建了融合特异标记的BmBDV与AcMNPV的嵌合体病毒,BmBDV的基因能随嵌合体病毒在Hi5细胞中表达,但因为BmBDV的基因组不能从嵌合体病毒基因组中释放出来,所以不能在Hi5细胞中拯救出有感染性的BmBDV粒子。我们的研究为深入研究BmBDV基因的表达调控机制提供了一种便捷的平台,并为创建新型生物防治剂,比如杆状病毒与浓核病毒及其他昆虫病毒的嵌合体病毒打下了基础。
任秀娟[7]（2020）在《基于马属动物家系基因组研究异种杂交不相容的遗传基础》文中研究说明马和驴是马属动物两个极为重要的物种,其共同祖先出现于上新世时期。直到230万年前仍然存在从马向驴的基因流。马和驴的物种分离是在极短的时间内快速完成的,这促使其形成了染色体间剧烈的结构变异和基因组序列间的高度相似。马和驴两个独立的物种杂交能够产骡,母骡甚至具有产驹的能力。这些突出的特点,使得马、驴和骡成为研究大型哺乳动物异种杂交的遗传基础,以及异源基因组不相容调控的分子机制,非常有价值的模型。为了在基因组和转录组水平评估马、驴杂交对骡机体适应性的影响,同时探索骡协调马和驴基因组不协调的分子机制。第一,我们利用Illumina测序平台对1个马属动物家系的全血样品进行全基因组测序,并以纯血马基因组为参考,以马和驴双亲基因组序列信息为辅助,分析骡SNP的遗传多样性;采用深度测序的方法,分析骡CNV的遗传多样性,并对相关基因进行富集分析。第二,利用Illumina测序平台对3个马属动物家系的全血样品进行RNA-Seq测序,并利用PacBio测序平台对该家系骡的全血样品进行全长转录组测序,分析骡在全长转录本水平发生的突变、基因间嵌合、物种间嵌合等结构变异,并对相关基因进行富集分析。第三,利用RNA-Seq数据,对马、驴和骡的基因表达量进行比较,分析骡特异性表达、亲本显性表达和非加性表达等表达模式的多样性,并对相关基因进行富集分析。第四,利用RNA-Seq数据,以马和驴双亲基因组序列信息为辅助,识别骡遗传自马或驴的SNP标签,并利用这些SNP标签,分析骡转录组中马和驴同源基因的表达偏移情况。经研究获得如下结果:1.通过家系1的基因组序列比较分析,识别了骡在基因组水平发生的31108个 MIE SNPs（Mendelian inheritance Error SNP）和 799个de novo SNPs。相关基因功能富集分析,发现骡遗传自马的16987个纯合MIE SNPs主要和同种异体移植排斥等机体“排异”途径相关;遗传自驴的1412 1个纯合MIE SNPs主要和癌症途径相关。骡基因组水平发生的这些点突变,可以降低马和驴基因组进化累积的异质性,从而提高其机体的适应性。2.以纯血马基因组为参考,借助SNP标签,用基于覆盖深度的方法,识别了骡经遗传获得的180个CNVs。对这些CNVs进行相关基因的功能富集分析,发现主要和嗅觉等性状相关。嗅觉性状的基因组剂量差异与致癌和“排异”等过程相比,一般不会引起致死,因此骡正常继承这些拷贝数的差异,可能只造成剂量上影响。3.整合PacBio和Illumina测序数据,以马、驴双亲基因组序列信息为辅助,在骡全长转录本水平进行结构变异分析,识别了 345个基因间嵌合体基因至少在1个个体中发生;21个物种间嵌合体基因至少在1个个体中发生;以及不同数量的骡特异性突变基因。对这些基因进行功能富集分析,发现基因间嵌合体基因主要和核糖体等相关;而骡特异性突变基因以及物种间嵌合体基因主要和机体的“排异”以及癌症过程相关。骡转录组水平发生的这些结构变异改变了基因的原本结构,从而影响其正常的表达过程,使其功能效能减弱,从而增强骡其机体的适应性。4.利用RNA-Seq数据,以纯血马基因组为参考,对3个马属动物家系转录组进行表达模式分析。识别了 666个骡特异性表达基因,这个数要明显高于马（403）和驴（187）。对骡特异性表达基因进行功能富集分析,发现主要和DNA修复及细胞生命活动相关。同时,在3个家系的骡转录组中,我们还分别识别到了 1805、2285和350个非加性表达基因。功能富集分析,发现主要和癌症途径以及基础修复过程直接相关。马和驴杂交的合成效应会对骡造成基因结构及表达模式的损伤。这些损伤会促发骡DNA损伤修复、基础修复以及细胞周期调控相关基因的大量表达、以及这些过程之间复杂的相互作用。从而来修复这些不利于其适应性的损伤。5.利用RNA-Seq数据,以纯血马基因组为参考,以马、驴双亲基因组序列信息为辅助,针对3个家系骡,我们分别筛选了 20443、9190和7126个HEB（Homoeolog expression bias）SNPs标签。利用这些HEB SNPs标签进行基因注释和同源表达偏移分析。我们共识别了 1136个基因至少在一个个体中为同源表达偏移基因。对这些基因进行功能富集分析,发现有3条显着富集的通路和机体的“排异”途径相关。而且这些基因,通过在马骡中显着偏向于表达驴的等位基因,在驴骡中显着偏向于表达马的等位基因,来降低机体对父本遗传特性（抗原物质）的排斥,从而增强其适应性。
张超[8]（2020）在《含寡聚脱氧氟尿苷的HER2靶向DNA纳米载体的构建及其抗肿瘤应用研究》文中研究说明核苷类似物作为一类非常传统的化疗药物,经常出现在许多恶性肿瘤的标准化疗方案中。但是,仍有许多缺点限制了它们的临床应用,如较差的肿瘤靶向性和血液稳定性、严重的副作用和欠佳的治疗效果。为了解决上述问题,研究人员通过纳米载体递送策略,使核苷类似物抗肿瘤药在血液中实现缓释,延长其半衰期,并凭借载体颗粒的主动或被动靶向性,实现药物的减毒增效。到目前为止,研究人员已经开发出各种各样由人工合成的有机纳米材料或无机纳米材料构成的药物递送系统,并取得了较好的治疗效果,但这些纳米材料的安全性及其在体内降解、代谢的途径还有待进行全面且详细的分析。另外,由于核苷类似物抗肿瘤药普遍水溶性好,这导致了纳米载体的载药量不能准确控制、重复性差等问题,使其工业化生产和临床应用受阻。因此,如何实现核苷类抗肿瘤药的精确载药且纳米载体安全可控,是目前急需解决的重要问题。此外,赋予化疗药物靶向性,对于提高其癌细胞的摄入效率,增强化疗药物治疗效果,降低其毒副作用,将起到至关重要的作用。因此,本文选择脱氧氟尿苷（FUdR,5-氟尿嘧啶的脱氧核苷形式）作为核苷类似物的代表性药物,利用它与正常核苷结构的相似性,通过DNA固相合成技术,将其整合到天然生物大分子DNA链中,然后与靶向HER2的小分子蛋白配体affibody偶联,设计并构建了3个以DNA材料为基础的靶向纳米颗粒,用于HER2阳性乳腺癌和胃癌的靶向治疗,并对其进行了靶向结合、生物降解和抑癌机制等方面的初步分析。具体的研究内容如下:（1）本文设计并构建了一种新的affibody-FUdR-DNA四面体纳米结构（affi-F/TDNs）,以实现FUdR的精准载药和靶向递送,并降低其毒副作用。通过DNA固相合成将FUdR整合到四条41-mer DNA链中。将affibody分子连接到其中一条DNA链的末端,以增强药物分子的靶向摄取。然后,自组装构建含有40个FUdR分子的DNA纳米颗粒,其载药率为19.6%。体外测试结果显示,affi-F/TDNs对过表达HER2的乳腺癌BT474细胞具有高选择性和特异性杀伤作用,而在HER2低表达的MCF-7细胞中则表现出低毒性。体内抗肿瘤结果表明,affi-F/TDNs在血液中具有较好的稳定性,实现了肿瘤区域内的积累,发挥了显着的抗肿瘤功效。因此,affibody-DNA四面体作为一种简单有效的主动靶向递送纳米载体,为核苷类抗肿瘤药物的运输提供了新途径。（2）为了实现核苷类似物与作用于DNA的蒽环类化疗药的靶向共递送,并提高两种药物联合化疗的治疗效果,本文利用金纳米颗粒（AuNPs）与DNA链连接的便利性和稳定性,成功构建了整合有寡聚FUdR的affibody-DNA-AuNPs（affi-F/AuNPs）,再利用阿霉素（Dox）能嵌入DNA双链的特性,实现了FUdR和Dox的共载。每个新的含双药的affibody-DNA-AuNPs,即Dox@affi-F/AuNPs,含有约30条具有寡聚FUdR的DNA杂合链,载有约800个FUdR分子和200个Dox分子。与FUdR和Dox的简单混合物相比,由于affibody介导的细胞内吞作用,Dox@affi-F/AuNPs表现出对过表达HER2的乳腺癌细胞更高的抑制作用,和更好的协同抗肿瘤活性。相关的机理研究证明,Dox@affi-F/AuNPs通过促进更多的细胞进入到细胞凋亡途径,实现了Dox和FUdR显着的联合抗肿瘤活性。本文的工作为靶向共递送核苷类似物和其他作用于DNA的化疗药物,提供了一个崭新的纳米载药平台,以实现针对HER2阳性肿瘤的协同治疗。（3）联合化疗是一种降低药物毒副作用,提升治疗效果的重要癌症治疗策略。然而,具有不同溶解特性的化疗药物在传统的药物递送系统中不容易实现共同运输。因此,本文首先将寡聚FUdR集成在affibody修饰的G-四链体DNA胶束中,构建了新的靶向DNA纳米药物载体（affi-F/GQs）以解决上述问题。affi-F/GQs在一系列测试中表现出良好的稳定性和靶向性。然后,利用姜黄素（Cur）的疏水性,将其封装到DNA胶束的疏水内核中,获得了同时装载FUdR和Cur的affi-F/GQs,即Cur@affi-F/GQs。其中,FUdR和Cur的载药率分别为21.1%和5.5%。与FUdR和Cur的物理混合物相比,Cur@affiF/GQs对HER2过表达的胃癌N87细胞显示出更高的细胞毒性和协同作用。此外,抗癌机制研究表明,Cur@affi-F/GQs增强了FUdR诱导的凋亡途径中相关蛋白的产生和活性。这项研究为同时递送溶解度显着不同的化疗药提供了一种有潜力的新载体。
罗丽丽[9]（2020）在《血小板内皮粘附分子在脓毒症DIC中的作用及机制研究》文中提出第一部分血浆s PECAM-1水平与脓毒症DIC发生及预后的相关性研究目的:探究血浆可溶性血小板内皮粘附分子（s PECAM-1）水平与脓毒症DIC发生及预后的相关性。方法:从武汉协和医院DIC病例库中随机挑选10名健康志愿者和69例疑诊为脓毒症DIC的患者,从DIC血浆样本库中随机挑选对应的一份血浆并记录患者相应信息。参照中国DIC诊断积分系统≥7分则诊断为DIC。根据SOFA评分≥2判断患者合并器官功能衰竭。将合并器官功能衰竭以及28天内死亡作为主要预后不良的指标。用ELISA的方法检测s PECAM-1的浓度。结果:健康对照组和疑诊脓毒症DIC组的性别及年龄无统计学差异。在69例疑诊DIC的脓毒症患者中,其中24例确诊为DIC,23例合并有器官功能衰竭,16例患者在28天内死亡。脓毒症DIC组血浆s PECAM-1显着高于健康对照组和脓毒症未合并DIC组（p<0.05）。在脓毒症患者中,死亡组s PECAM-1水平显着高于生存组（p<0.05）;器官功能衰竭组s PECAM-1显着高于未发生器官功能衰竭组（p<0.05）。在24例DIC患者中,死亡14例,死亡组s PECAM-1水平显着高于生存组（p<0.05）。s PECAM-1与DIC积分的Spearman相关系数为0.401,呈中等相关性（p<0.05）。血浆s PECAM-1预测脓毒症DIC发生的ROC曲线下面积为0.814（95%置信区间0.7030.926,p<0.05）,当截断值为16.69ng/m L时,特异性高达94.5%,敏感性为62.5%。结论:血浆s PECAM-1与脓毒症DIC的发生及预后密切相关,对脓毒症DIC具有较好的诊断效能。第二部分用CRISPR/Cas9技术建立并鉴定PECAM-1基因敲除小鼠目的:利用CRISPR/Cas9技术敲除C57BL/6小鼠PECAM-1基因并予以验证。方法:根据PECAM-1基因组和蛋白保守区结构,寻找3号外显子序列中的原间隔序列临近基序（protospacer adjacent motif,PAM）,其紧邻的上游20nt作为CRISPR/Cas9的靶序列,根据靶序列设计相应成对的sg RNA。利用sp Cas9/g RNA靶点效率检测试剂盒,选取酶切靶点DNA活性最高的g RNA靶点转录成RNA,与sp Cas91.1蛋白一起注射到小鼠受精卵内。小鼠出生后,利用PCR琼脂糖凝胶电泳分析基因型,切胶回收后送基因测序。利用肝脏组织免疫组化以及脾脏组织蛋白印迹验证PECAM-1在蛋白水平的表达。未刺激状态下,观察比较野生型和基因敲除小鼠的行为,比较两者血常规、凝血功能、肝肾功能及炎症因子等指标的差异。结果:在PECAM-1基因的3号外显子中根据PAM序列设计了4个CRISPR/Cas9靶序列。sp Cas9/g RNA靶点效率检测表明g2（TCATGGGAGGTGATGAATGGG）的切割活性最高,接近90%左右。8只F0代小鼠中,其中一只的一条染色体缺失了226个碱基,PECAM-1发生移码突变。在后续繁殖过程中,杂合子与杂合子、杂合子与纯合子、纯合子与纯合子之间均可正常繁殖。肝脏免疫组化和脾脏蛋白印迹结果均显示基因敲除小鼠无PECAM-1的表达。生理条件下,基因敲除小鼠和野生型小鼠在行为上无明显差异,血常规、凝血功能、肝肾功能及炎症因子等指标也无明显异。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功敲除C57BL/6小鼠PECAM-1基因,在基因和蛋白水平得到了验证,为后续实验奠定了基础。第三部分探究PECAM-1在脓毒症DIC中的作用目的:探究PECAM-1在脓毒症DIC小鼠模型中的作用。方法:在性别及体重匹配的PECAM-1基因敲除（knockout,KO）和野生型（wildtype,WT）小鼠中,利用单次大剂量腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS,型号O111:B4,50 mg/kg）或盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture,CLP）模拟脓毒症DIC。通过全身放疗后回输骨髓单个核细胞构建嵌合体,根据供受体差异分为四组:供受体均为WT小鼠（WT-WT）、供体为WT小鼠而受体为KO小鼠（WT-KO）、供体为KO小鼠而受体为WT小鼠（KO-WT）以及供受体均为KO小鼠（KO-KO）。移植8周后通过流式检测表达PECAM-1的外周血T淋巴细胞比例鉴定表型。在造模后不同时间节点检测DIC相关指标以及肝肾功能,记录生存曲线。通过ELISA检测血浆中可溶性血栓调节蛋白（soluble thrombomodulin,s TM）、凝血酶-抗凝血酶复合物（thrombin-antithrombin complex,TAT）以及纤溶酶原激活物抑制物1（plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1）的浓度。通过免疫组化检测肝脏组织因子（tissue factor,TF）的表达以及肝肾肺组织纤维蛋白的沉积。结果:未刺激时,WT和KO小鼠DIC相关指标无显着差异。造模后,与WT小鼠相比,KO小鼠血小板数量及血浆抗凝血酶Ⅲ活性的下降更显着（p<0.05）,KO小鼠血浆中纤维蛋白降解产物、s TM、TAT及PAI-1升高的程度更明显（p<0.05）,KO小鼠肝脏TF的表达更丰富;KO小鼠肝肾肺组织中纤维蛋白沉积更多;KO小鼠血清肌酐和尿素氮水平升高更显着（p<0.05）。在LPS或者CLP诱导的脓毒症DIC中,KO小鼠的死亡率显着高于WT小鼠,TF抑制剂PCI-27483可以有效降低KO小鼠的死亡率（p<0.05）。WT-WT、WT-KO、KO-WT及KO-KO小鼠表达PECAM-1的外周血T淋巴细胞比例分别为96%、76%、24%和0%。LPS刺激6h后,四种小鼠血小板下降趋势、肝肾肺组织中纤维蛋白的沉积范围以及血浆s TM、TAT和PAI-1的升高趋势均为KO-KO>KO-WT及WT-KO>WT-WT（p<0.05）。结论:PECAM-1可抑制小鼠脓毒症DIC的发生并改善预后。内皮细胞来源的PECAM-1和造血来源的PECAM-1在脓毒症DIC中起程度相似的抑制作用。第四部分探究PECAM-1抑制脓毒症DIC的机制目的:探究PECAM-1抑制脓毒症DIC的机制。方法:利用单次大剂量腹腔注射LPS模拟脓毒症DIC,造模后不同时间节点收集血样及组织样本。利用免疫组化检测肺间质中性粒细胞、巨噬细胞的浸润程度。通过流式CBA检测炎症因子IL-6、TNF-a、MCP-1及IL-10的水平,ELISA测量IL-1β水平。通过流式检测腹腔中M1型和M2型巨噬细胞（peritoneal macrophages）的比例。通过粒细胞集落刺激因子诱导、培养骨髓巨噬细胞（bone marrow derived macrophages,BMMs）。给予PMs及BMMs不同的刺激条件（空白对照、Lipo3000、LPS预刺激后分别给予LPS、Lipo3000转染的LPS）,然后检测乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）释放比和IL-1β水平,并在显微镜下观察细胞形态。利用流式检测PMs焦亡比例（晚凋群）。通过伊文思蓝实验评估血管屏障功能。结果:LPS刺激8h后,与WT小鼠相比,KO小鼠肺间质内中性粒细胞及巨噬细胞浸润程度更大。DIC造模后,KO小鼠血浆中促炎因子IL-6、TNF-a及MCP-1升高水平较WT小鼠更显着（p<0.05）,而抗炎因子IL-10在WT小鼠中升高更明显（p<0.05）,提示KO小鼠循环中促炎/抗炎因子平衡破坏更严重。小鼠腹腔内以M1型巨噬细胞为主。未刺激时,WT及KO小鼠M1和M2型巨噬细胞比例无明显差异（p>0.05）;LPS刺激8h后,KO小鼠腹腔内M1巨噬细胞比例高于WT小鼠,且有统计学意义（p<0.05）。与LPS转染的WT型PMs及BMMs相比,LPS转染的KO型PMs及BMMs释放的LDH比例和IL-1β水平更高,经历焦亡的细胞比例也更多（p<0.05）。LPS刺激后,KO小鼠血浆中IL-1β的水平显着高于WT小鼠（p<0.05）。伊文思蓝渗透性实验发现,LPS刺激后,KO小鼠心肝肾肺组织中伊文思蓝的沉积显着多于WT小鼠（p<0.05）。结论:PECAM-1通过抗炎作用抑制脓毒症DIC,至少有两个机制,抑制巨噬细胞的焦亡和修复血管屏障。
彭耀进,李伟[10]（2020）在《生命科技伦理问题与治理策略——以人-动物嵌合体研究为例》文中指出新兴生命科技领域中人-动物嵌合体研究意义重大,同时其在公众厌恶、对"非自然"和模糊物种界限的担忧、对嵌合体生物伦理地位的不确定、有损人性尊严以及滑坡论等方面存有巨大的伦理、社会争议,进而给当下法律规则和治理体系带来前所未有的挑战。研究认为,基于人-动物嵌合体研究不可否认的益处以及潜藏的伦理、社会争议,争议因具体研究类型而异,不应简单地允许或禁止一切嵌合体研究,而应采取密切监控、个案分析的适应性灵活治理策略。从法律与伦理规范、审查与监督管理、公众探讨与科学传播等多个维度提出治理策略相关建议,以争生命科技领域发展与伦理限制之二维平衡,保障该领域健康有序发展。
二、嵌合体动物技术研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、嵌合体动物技术研究进展（论文提纲范文）
（2）乌骨绵羊诱导多能干细胞的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 乌骨羊 |
| 1.2 多能干细胞的概述 |
| 1.2.1 多能干细胞的起源 |
| 1.2.2 在体外获取不同多能状态的干细胞 |
| 1.3 家畜胚胎干细胞的研究进展 |
| 1.3.1 牛、猪、绵羊胚胎干细胞的研究进展 |
| 1.3.2 Wnt信号通路是维持家畜多能干细胞的关键信号 |
| 1.4 家畜诱导多能干细胞的研究进展 |
| 1.4.1 家畜PSCs重编程的方法 |
| 1.4.2 牛诱导性多能干细胞的研究进展 |
| 1.4.3 山羊及绵羊诱导性多能干细胞的研究进展 |
| 1.5 多能干细胞在家畜物种中的应用 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 乌骨绵羊成纤维细胞的分离及饲养层细胞的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器及耗材 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 细胞培养液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 乌骨绵羊成纤维细胞系的建立 |
| 2.2.2 STO feeder的制备 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 乌骨绵羊耳成纤维细胞的原代培养 |
| 2.3.2 乌骨绵羊耳成纤维细胞的传代 |
| 2.3.3 乌骨绵羊耳成纤维细胞的生长曲线 |
| 2.3.4 乌骨绵羊成纤维细胞支原体检测结果 |
| 2.3.5 乌骨绵羊成纤维细胞染色体分析结果 |
| 2.3.6 乌骨绵羊耳成纤维细胞的复苏效果 |
| 2.3.7 STO细胞解冻后的状态 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT表达载体的构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验仪器及耗材 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.1.4 质粒 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 质粒PB-TRE-hRL、pBABE-hygro-hTERT、pSG5 LargeT simian virus的转化与提取 |
| 3.2.2 线性载体的制备 |
| 3.2.3 目的基因的获得 |
| 3.2.4 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT表达载体的构建与鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT表达载体质粒图谱 |
| 3.3.2 质粒PB-TRE-hRL酶切结果 |
| 3.3.3 sLargeT和 hTERT基因RT-PCR扩增产物电泳结果 |
| 3.3.4 PB-TRE-sLhT载体构建中间基因RT-PCR扩增产物电泳结果 |
| 3.3.5 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT测序结果 |
| 3.3.6 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT电转染成纤维细胞结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 乌骨绵羊诱导多能干细胞的建立 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验仪器及耗材 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.1.4 质粒 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 电转染 |
| 4.2.2 乌骨绵羊iPSCs的传代及冻存 |
| 4.2.3 乌骨绵羊iPSCs内源基因表达情况的检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 不同诱导体系的iPSCs细胞系建系率 |
| 4.3.2 不同诱导体系获得的iPSCs克隆形态的比较 |
| 4.3.3 不同诱导体系诱导初期iPSCs细胞克隆的形态变化 |
| 4.3.4 不同诱导体系获得的iPSCs细胞系内源基因激活情况 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 乌骨绵羊iPSCs发育潜能的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验仪器及耗材 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验动物 |
| 5.1.4 主要试剂的配制 |
| 5.1.5 质粒 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 siPSC-4和siPSC-6 外源转基因检测 |
| 5.2.2 碱性磷酸酶染色 |
| 5.2.3 免疫组织化学检测 |
| 5.2.4 拟胚体体外分化 |
| 5.2.5 畸胎瘤体内分化 |
| 5.2.6 siPSC-4减DOX培养测试 |
| 5.2.7 siPSC-4 异种嵌合能力检测 |
| 5.2.8 siPSC-4 同种嵌合能力检测 |
| 5.2.9 转录组文库构建、测序及分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 siPSC-4和siPSC-6 细胞干细胞特性分析 |
| 5.3.2 经典培养液中siPSC-4 细胞形态及内源基因的表达 |
| 5.3.3 无饲养层细胞条件下培养siPSC-4 内源基因表达检测 |
| 5.3.4 siPSC-4 细胞嵌合体发育潜能分析 |
| 5.3.5 RNA测序结果分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）高亮度的单体化远红光与近红外藻胆蛋白荧光探针的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 序言 |
| 1.1 蓝细菌的光合作用 |
| 1.1.1 藻胆体及其能量传递机制 |
| 1.1.2 藻胆蛋白 |
| 1.1.3 胆色素及其生物合成 |
| 1.1.4 藻胆蛋白的生物合成 |
| 1.1.5 连接蛋白 |
| 1.2 光敏色素 |
| 1.3 荧光蛋白的研究进展 |
| 1.3.1 绿色荧光蛋白家族 |
| 1.3.2 橙红色荧光蛋白家族 |
| 1.3.3 结合胆绿素的近红外荧光蛋白 |
| 1.4 超分辨显微技术 |
| 1.5 本课题研究目的与意义 |
| 2 基于7335ApcE2与7203ApcF2嵌合的近红外荧光探针研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 主要材料 |
| 2.2.2 培养基与试剂 |
| 2.2.3 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 定点诱变和缺失诱变 |
| 2.3.2 制备感受态细胞 |
| 2.3.3 蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.4 吸收和荧光光谱的测定 |
| 2.3.5 摩尔消光系数、荧光量子产率及分子亮度的测定 |
| 2.3.6 序列比对 |
| 2.3.7 三维结构的模拟 |
| 2.3.8 色素的萃取 |
| 2.3.9 荧光寿命的测定 |
| 2.3.10 融合基因表达质粒的构建 |
| 2.3.11 融合基因标记质粒的构建 |
| 2.3.12 动物细胞的复苏、培养与转染 |
| 2.3.13 荧光蛋白在动物细胞内亮度的测定 |
| 2.3.14 蛋白浓度和色素浓度的测定 |
| 2.3.15 蛋白pH稳定性的测定 |
| 2.3.16 蛋白热稳定性的测定 |
| 2.3.17 蛋白聚集态的体外分析 |
| 2.3.18 蛋白聚集态的体内分析 |
| 2.3.19 正置荧光显微镜对色素蛋白的成像 |
| 2.3.20 蛋白标记细胞的SIM成像 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 由ApcE2进化的可溶性藻胆蛋白BDFP3的获得 |
| 2.4.2 色素PФB制备产量的提高 |
| 2.4.3 7335ApcE2与7203ApcF2三联嵌合体的获得 |
| 2.4.4 BDFP1.1/1.2: BDFP3.1: BDFP1.1/1.2的荧光寿命的研究 |
| 2.4.5 FRET提高融合蛋白在细胞内有效亮度的研究 |
| 2.4.6 融合蛋白聚集态的分析 |
| 2.4.7 融合蛋白稳定性的分析 |
| 2.4.8 融合蛋白在哺乳动物细胞中超分辨成像 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 3 基于7335ApcE2与7203ApcF2嵌合的远红光荧光探针研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 主要材料 |
| 3.2.2 培养基与试剂 |
| 3.2.3 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.2 吸收和荧光光谱的测定 |
| 3.3.3 蛋白光谱参数的计算 |
| 3.3.4 圆二色光谱的测定 |
| 3.3.5 荧光寿命的测定 |
| 3.3.6 SDS-PAGE和染色 |
| 3.3.7 融合基因表达质粒的构建 |
| 3.3.8 融合基因标记质粒的构建 |
| 3.3.9 动物细胞的复苏、培养与转染 |
| 3.3.10 细胞内亮度的测定 |
| 3.3.11 蛋白浓度和色素浓度的测定 |
| 3.3.12 色素蛋白的酶解 |
| 3.3.13 蛋白pH和热稳定性的测定 |
| 3.3.14 蛋白聚集态的体外分析 |
| 3.3.15 蛋白聚集态的体内分析 |
| 3.3.16 融合蛋白的SIM超分辨成像 |
| 3.3.17 高分辨率激光共聚焦扫描显微成像 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 可溶性BDFP3非共价结合PEB的研究 |
| 3.4.2 极亮的红色荧光蛋白BDFP3.3的获得 |
| 3.4.3 7335ApcE2与7203ApcF2三联嵌合体的获得 |
| 3.4.4 BDFP1.2/1.6: BDFP3.3: BDFP1.2/1.6的荧光寿命的研究 |
| 3.4.5 FRET提高融合蛋白在细胞内有效亮度的研究 |
| 3.4.6 用BDFP3.3的酶解液代替游离的色素PEB |
| 3.4.7 BDFP3.3及其融合蛋白的聚集态分析 |
| 3.4.8 BDFP3.3及其融合蛋白的稳定性分析 |
| 3.4.9 BDFP3.3及其融合蛋白在哺乳动物细胞中标记成像 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 4 基于ApcF2的远红光单体高亮度荧光蛋白的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 主要材料 |
| 4.2.2 培养基与试剂 |
| 4.2.3 主要实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 诱变体库的构建方法 |
| 4.3.2 诱变体的蛋白表达与纯化 |
| 4.3.3 诱变体的序列鉴定 |
| 4.3.4 蛋白的聚集态分析 |
| 4.3.5 蛋白的序列比对 |
| 4.3.6 三维结构的模拟 |
| 4.3.7 诱变体的结晶 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 远红光单体BDFPs的随机诱变筛选结果 |
| 4.4.2 诱变体的亮度分析 |
| 4.4.3 诱变体v9的晶体筛选 |
| 4.4.4 诱变体v9的晶体结构的分析 |
| 4.4.5 smURFP晶体结构的分析 |
| 4.4.6 基于诱变体v9晶体结构的BDFPs的优化 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 5 论文总结 |
| 5.1 本文小结 |
| 5.2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）丝氨酸蛋白酶抑制因子Spink7促进炎症消退的作用与机制探索 ——基于小鼠创面愈合与结肠炎模型的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究目的 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 研究方法 |
| 第二章 Spink7 促进小鼠创面炎症消退的作用及机制研究 |
| 第一节 Spink7 在小鼠皮肤创伤愈合过程中的表达模式及si RNAs敲降Spink7 对创面愈合的影响 |
| 2.1.1 材料与试剂配制 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 小结 |
| 第二节 Spink7 基因敲除对小鼠创面炎症消退的影响 |
| 2.2.1 材料与试剂配制 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 小结 |
| 第三节 Spink7 调控创面炎症消退机制的初步探讨 |
| 2.3.1 材料与试剂配制 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 小结 |
| 第四节 siRNA敲降Spink7 促进小鼠放创复合伤创面愈合的初步研究 |
| 2.4.1 材料与试剂配制 |
| 2.4.2 实验方法 |
| 2.4.3 实验结果 |
| 2.4.4 小结 |
| 第五节 讨论 |
| 第三章 Spink7 对小鼠实验性结肠炎的保护作用研究 |
| 第一节 Spink7 缺失对DSS诱导的实验性结肠炎的影响 |
| 3.1.1 材料与试剂配制 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.1.4 小结 |
| 第二节 中性粒细胞来源的Spink7 在实验性结肠炎中发挥主要保护作用 |
| 3.2.1 材料与试剂配制 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.2.4 小结 |
| 第三节 Spink7 在人炎症性肠病样本中的表达情况检测 |
| 3.3.1 材料与试剂配制 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.3 实验结果 |
| 3.3.4 小结 |
| 第四节 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述KAZAL型丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK7 在食管疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 非人灵长类胚胎早期发育 |
| 1.2.1 配子形成 |
| 1.2.2 受精 |
| 1.2.3 卵裂 |
| 1.2.4 囊胚形成 |
| 1.2.5 植入 |
| 1.2.6 早期胚胎发育的分子调控 |
| 1.2.7 早期胚胎发育与环境应激 |
| 1.3 非人灵长类胚胎早期发育调控研究 |
| 1.3.1 单细胞组学技术揭示胚胎早期发育的分子调控 |
| 1.3.2 利用体细胞核移植研究胚胎重编程过程 |
| 1.4 非人灵长类疾病模型研究 |
| 1.4.1 非人灵长类基因组编辑研究现状 |
| 1.4.2 基因编辑技术的安全性问题 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 基于单细胞转录组测序的猕猴胚胎植入前发育研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料与方法 |
| 2.3.1 动物来源 |
| 2.3.2 实验主要试剂 |
| 2.3.3 实验主要仪器 |
| 2.3.4 卵母细胞采集 |
| 2.3.5 建立体外受精/体细胞核移植/孤雌激活/孤雄发育胚胎 |
| 2.3.6 胚胎培养 |
| 2.3.7 单细胞样本收集 |
| 2.3.8 单细胞转录组数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 单精子注射、体细胞核移植、单性生殖胚胎的植入前转录图谱 |
| 2.4.2 猕猴胚胎植入前发育的转录阻滞 |
| 2.4.3 猕猴植入前胚胎转录组的母源—合子转化 |
| 2.4.4 表观遗传调控相关基因的异常表达与胚胎阻滞相关 |
| 2.4.5 通过降低核移植胚胎中异常的H3K9me3修饰提高胚胎发育率 |
| 2.5 讨论及小结 |
| 第三章 建立DAX1基因靶向编辑的食蟹猴模型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料与方法 |
| 3.3.1 实验主要试剂和仪器 |
| 3.3.2 动物来源、卵采集、体外受精 |
| 3.3.3 建立DAX1基因靶向编辑食蟹猴 |
| 3.3.4 编辑效率检测:T7酶切及测序 |
| 3.3.5 脱靶检测 |
| 3.3.6 H&E染色 |
| 3.3.7 免疫组化和免疫荧光检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 建立DAX1基因靶向修饰的食蟹猴模型 |
| 3.4.2 Cas9介导的模型猴生殖系细胞DAX1基因靶向突变 |
| 3.4.3 DAX1基因突变引起模型猴猴睾丸发育异常 |
| 3.4.4 DAX1基因突变不会导致支持细胞发育异常 |
| 3.4.5 DAX1基因突变导致Wnt/β-catenin信号通路异常上调 |
| 3.4.6 DAX1基因突变引起模型猴肾上腺发育异常 |
| 3.5 讨论及小结 |
| 第四章 食蟹猴胚胎的干细胞嵌合研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料与方法 |
| 4.3.1 食蟹猴多能干细胞系的建立 |
| 4.3.2 多能干细胞的荧光标记 |
| 4.3.3 干细胞体外分化实验 |
| 4.3.4 构建嵌合体胚胎 |
| 4.3.5 胚胎培养/延迟培养及胚胎移植 |
| 4.3.6 免疫组化染色 |
| 4.3.7 胚胎移植、孕检、胎儿及新生猴组织样本采集 |
| 4.3.8 胎猴/新生猴组织处理 |
| 4.3.9 特异性基因PCR检测 |
| 4.3.10 单细胞RNA-seq |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 建立多能干细胞嵌合猴胚胎 |
| 4.4.2 建立多能干细胞嵌合食蟹猴 |
| 4.4.3 通过基因表达谱分析揭示多能干细胞的嵌合机制 |
| 4.4.4 食蟹猴pESCs在成体猴生殖系的嵌合 |
| 4.4.5 胚胎微环境影响多能干细胞嵌合效率 |
| 4.5 讨论及小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间发表论文目录 |
| 附录 B 实验动物伦理审批表 |
| 附录 C 其他需要说明的内容 |
（6）杆状病毒AcMNPV与家蚕二分浓核病毒嵌合体病毒的构建及其特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 家蚕二分浓核病毒 |
| 1.1.1 家蚕二分浓核病毒的分类 |
| 1.1.2 家蚕二分浓核病毒的病理特征 |
| 1.1.3 家蚕二分浓核病毒的基因组结构与功能 |
| 1.2 病毒拯救 |
| 1.3 BmBDV的拯救 |
| 1.4 嵌合体病毒 |
| 1.5 昆虫杆状病毒表达系统 |
| 1.6 立题依据和意义 |
| 1.6.1 立题依据 |
| 1.6.2 立题意义 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 1.8 主要技术路线 |
| 第二章 BmBDV基因组VD1、VD2 转座质粒的构建 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂及溶液 |
| 2.1.3 实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 标签位点的确定及酶切位点的选择 |
| 2.2.3 BmBDV重组质粒的构建及检测 |
| 2.2.4 感受态细胞的制备 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 BmBDV基因组VD1 中各片段的获取和验证 |
| 2.3.2 BmBDV VD1 转座质粒的构建及检测 |
| 2.3.3 BmBDV基因组VD2 中各片段的获取和验证 |
| 2.3.4 BmBDV VD2 转座质粒的构建及检测 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 Ac MNPV与 BmBDV嵌合体病毒的构建 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 主要试剂与缓冲液 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 嵌合体病毒的构建 |
| 3.2.2 嵌合体病毒Bacmid的鉴定 |
| 3.2.3 嵌合体病毒Bacmid DNA的提取 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 AcMNPV与 BmBDV嵌合体病毒的构建 |
| 3.3.2 AcMNPV与 BmBDV嵌合体病毒的验证 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 嵌合体病毒基因在细胞中的表达分析 |
| 4.1 材料、试剂与仪器 |
| 4.1.1 材料和试剂 |
| 4.1.2 主要缓冲液 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 昆虫细胞培养 |
| 4.2.2 昆虫细胞转染 |
| 4.2.3 嵌合体病毒上清液的制备 |
| 4.2.4 嵌合体病毒感染昆虫细胞 |
| 4.2.5 RT-PCR相关实验 |
| 4.2.6 Western Blot相关实验 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 嵌合体病毒感染昆虫细胞病理观察 |
| 4.3.2 嵌合体病毒基因的转录分析 |
| 4.3.3 嵌合体病毒基因的蛋白表达分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 BmBDV的拯救分析 |
| 5.1 材料和试剂 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 主要试剂和溶液 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 嵌合体病毒感染细胞的收集与处理 |
| 5.2.2 嵌合体病毒感染Hi5细胞裂解液回感家蚕二龄起蚕幼虫 |
| 5.2.3 家蚕幼虫的饲养与解剖 |
| 5.2.4 RT-PCR检测嵌合体病毒在中肠中的转录 |
| 5.2.5 Western Blot检测家蚕嵌合体病毒在中肠中的表达 |
| 5.3 结果及分析 |
| 5.3.1 家蚕病理性观察 |
| 5.3.2 RT-PCR检测嵌合体病毒在中肠中的转录 |
| 5.3.3 Western Blot检测嵌合体病毒在中肠中的表达 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第六章 BmBDV基因组的拯救分析 |
| 6.1 材料和试剂 |
| 6.1.1 主要材料与试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 病变细胞基因组DNA的提取 |
| 6.2.2 探针设计、检测与合成 |
| 6.2.3 GEL的准备 |
| 6.2.4 转膜和固定 |
| 6.2.5 杂交 |
| 6.2.6 化学发光法检测 |
| 6.3 结果和分析 |
| 6.3.1 探针的标记与检测 |
| 6.3.2 Southern Blot检测BmBDV基因组 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 主要工作总结 |
| 7.2 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的学术成果 |
（7）基于马属动物家系基因组研究异种杂交不相容的遗传基础（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 马属动物进化特征概述 |
| 1.1.1 物种概念和界定 |
| 1.1.2 马属动物物种进化的连续性 |
| 1.1.3 马属动物物种分类的间断性 |
| 1.1.4 马属动物物种分离不完全性 |
| 1.2 异种杂交现象概述 |
| 1.2.1 异种杂交的普遍性 |
| 1.2.2 异种杂交的生物学意义 |
| 1.2.3 异种杂交不相容机制研究概述 |
| 1.2.4 马、驴异种杂交研究进展 |
| 1.3 基因组学的研究领域概述 |
| 1.3.1 De novo基因组研究 |
| 1.3.2 群体基因组研究 |
| 1.3.3 基于家系基因组研究 |
| 1.4 异种杂交个体基因组学研究领域概述 |
| 1.4.1 异种杂交个体基因组研究概述 |
| 1.4.2 马、驴、骡基因组研究进展 |
| 1.5 异种杂交个体转录组学研究领域概述 |
| 1.5.1 异种杂交个体转录组研究概述 |
| 1.5.2 马、驴、骡转录组研究进展 |
| 1.6 本研究的研究内容 |
| 1.7 本研究的选题依据 |
| 1.8 本研究的目的意义 |
| 1.9 本研究的技术路线 |
| 2 研究一 马属动物家系基因组比较研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验数据 |
| 2.1.3 实验主要数据库及分析软件 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 测序及比对结果 |
| 2.2.2 SNP和InDel结果 |
| 2.2.3 SNP注释 |
| 2.2.4 骡核基因组中孟德尔遗传错误SNPs和de novo SNPs的分析 |
| 2.2.5 家系CNV遗传多样性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 SNPs免疫相关基因富集结果分析 |
| 2.3.2 SNPs癌症相关基因富集结果 |
| 2.3.3 CNVs遗传多样性结果分析 |
| 2.4 小结 |
| 3 研究二 马属动物家系转录结构多样性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物和材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 实验主要数据分析软件 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 实验动物亲子鉴定结果 |
| 3.2.2 总RNA提取和文库构建的质检结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 研究三 马属动物家系转录组表达模式研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物和数据 |
| 4.1.2 实验主要数据分析软件 |
| 4.1.3 骡特异性表达基因注释 |
| 4.1.4 定量及表达水平分析 |
| 4.1.5 差异表达分析 |
| 4.1.6 表达分类分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 骡特异性表达基因结果分析 |
| 4.2.2 定量及差异表达结果 |
| 4.2.3 表达分类和亲本显性表达结果分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 研究四马属动物家庭转录组表达偏移研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物和数据来源 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 同源表达偏移基因识别 |
| 5.2.2 同源表达偏移基因表达趋势分析 |
| 5.2.3 同源表达偏移基因富集分析结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论 |
| 6.1 本研究的总结论 |
| 6.2 本研究的创新点 |
| 7 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（8）含寡聚脱氧氟尿苷的HER2靶向DNA纳米载体的构建及其抗肿瘤应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症现状、治疗策略和所面临的问题 |
| 1.1.1 癌症现状 |
| 1.1.2 癌症的治疗策略和所面临的问题 |
| 1.2 5-氟尿嘧啶与癌症治疗 |
| 1.2.1 5-氟尿嘧啶及其作用机理 |
| 1.2.2 5-氟尿嘧啶用于癌症治疗的现状和问题 |
| 1.3 DNA纳米载体的研究进展 |
| 1.3.1 DNA纳米载体的设计与构建 |
| 1.3.2 DNA纳米载体用于癌症治疗 |
| 1.3.3 DNA纳米载体的应用前景和需要解决的问题 |
| 1.4 HER2与癌症的关系及靶向治疗 |
| 1.4.1 HER2与癌症的关系 |
| 1.4.2 HER2作为靶标的单抗治疗及其研究进展 |
| 1.4.3 靶向HER2的抗体模拟物affibody分子及其相关研究 |
| 1.5 本论文的研究目的和主要内容 |
| 第二章 载有寡聚脱氧氟尿苷的affibody-DNA四面体用于靶向治疗HER2阳性乳腺癌 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 试剂与材料 |
| 2.2.2 菌株、质粒、细胞和动物 |
| 2.2.3 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 脱氧氟尿苷亚磷酰胺单体(FUd R phosphoramidite)的合成 |
| 2.3.2 含FUd R的DNA链的固相合成 |
| 2.3.3 A13F10-affibody嵌合体的合成与纯化 |
| 2.3.4 DNA四面体纳米颗粒的制备 |
| 2.3.5 化合物、DNA链和DNA纳米颗粒的表征 |
| 2.3.6 affi-F/TDNs纳米颗粒在血清中的稳定性研究 |
| 2.3.7 affi-F/TDNs纳米颗粒释放FUd R的体外研究 |
| 2.3.8 细胞培养 |
| 2.3.9 affi-F/TDNs纳米颗粒的细胞摄入研究 |
| 2.3.10 affi-F/TDNs纳米颗粒的细胞毒性测定 |
| 2.3.11 affi-F/TDNs纳米颗粒的细胞凋亡检测 |
| 2.3.12 动物模型的构建 |
| 2.3.13 affi-F/TDNs纳米颗粒的体内生物分布研究 |
| 2.3.14 affi-F/TDNs纳米颗粒的体内抗肿瘤研究 |
| 2.3.15 统计分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 脱氧氟尿苷亚磷酰胺单体(FUd R phosphoramidite)的表征 |
| 2.4.2 含FUd R的DNA链的制备 |
| 2.4.3 A13F10-affibody嵌合体的合成与表征 |
| 2.4.4 affi-F/TDNs纳米颗粒的制备和表征 |
| 2.4.5 affi-F/TDNs纳米颗粒的稳定性 |
| 2.4.6 affi-F/TDNs纳米颗粒的细胞摄取 |
| 2.4.7 affi-F/TDNs纳米颗粒的细胞毒性 |
| 2.4.8 affi-F/TDNs纳米颗粒引起的细胞凋亡 |
| 2.4.9 affi-F/TDNs纳米颗粒在荷瘤小鼠体内的分布情况 |
| 2.4.10 affi-F/TDNs纳米颗粒的体内抗肿瘤研究 |
| 2.5 本章结论 |
| 第三章 共载寡聚脱氧氟尿苷和阿霉素的affibody-DNA功能化的金纳米颗粒用于靶向联合治疗HER2阳性乳腺癌 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 试剂与材料 |
| 3.2.2 菌株、质粒和细胞 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 含FUd R的DNA链F/DNA1-SH和F/DNA2-NH2的固相合成 |
| 3.3.2 F/DNA2-affibody嵌合体的合成和纯化 |
| 3.3.3 FUd R-DNA链的表征 |
| 3.3.4 金纳米颗粒(Au NPs)的合成 |
| 3.3.5 affi-F/Au NPs和Dox@affi-F/Au NPs的制备 |
| 3.3.6 Au NPs、affi-F/Au NPs和Dox@affi-F/Au NPs的表征 |
| 3.3.7 Dox@affi-F/Au NPs的载药研究 |
| 3.3.8 Dox@affi-F/Au NPs的体外药物释放研究 |
| 3.3.9 affi-F/Au NPs和Dox@affi-F/Au NPs的核酸酶降解测试 |
| 3.3.10 细胞培养 |
| 3.3.11 Dox@affi-F/Au NPs的细胞摄入研究 |
| 3.3.12 affi-F/Au NPs和Dox@affi-F/Au NPs的细胞毒性测定 |
| 3.3.13 affi-F/Au NPs和Dox@affi-F/Au NPs对细胞凋亡的影响 |
| 3.3.14 统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 F/DNA1-SH和F/DNA2-affibody嵌合体的合成与表征 |
| 3.4.2 affi-F/Au NPs和Dox@affi-F/Au NPs的制备和表征 |
| 3.4.3 Dox@affi-F/Au NPs的载药 |
| 3.4.4 Dox@affi-F/Au NPs的体外药物释放 |
| 3.4.5 Dox@affi-F/Au NPs的细胞摄取 |
| 3.4.6 Dox@affi-F/Au NPs的体外细胞毒性和协同治疗 |
| 3.4.7 Dox@affi-F/Au NPs的细胞凋亡检测 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 共载寡聚脱氧氟尿苷和姜黄素的affibody-G四链体DNA胶束用于靶向联合治疗HER2阳性胃癌 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 试剂与材料 |
| 4.2.2 菌株、质粒和细胞 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 含FUd R的DNA链c F10G6-Chl和c F13-NH2的固相合成 |
| 4.3.2 c F13-affibody嵌合体的合成和纯化 |
| 4.3.3 FUd R-DNA链的表征 |
| 4.3.4 G四链体DNA胶束affi-F/GQs的自组装 |
| 4.3.5 affi-F/GQs临界胶束浓度(CMC)的测定 |
| 4.3.6 affi-F/GQs的稳定性分析 |
| 4.3.7 Cur@affi-F/GQs的制备 |
| 4.3.8 affi-F/GQs和Cur@affi-F/GQs的表征 |
| 4.3.9 Cur@affi-F/GQs的药物装载研究 |
| 4.3.10 Cur@affi-F/GQs的体外药物释放研究 |
| 4.3.11 细胞培养 |
| 4.3.12 affi-F/GQs和Cur@affi-F/GQs的细胞摄入研究 |
| 4.3.13 affi-F/GQs和Cur@affi-F/GQs的细胞毒性测定 |
| 4.3.14 Western Blot分析 |
| 4.3.15 Caspase活性检测 |
| 4.3.16 统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 affi-F/GQs的结构设计 |
| 4.4.2 c F10G6-Chl和c F13-affibody嵌合体的制备和表征 |
| 4.4.3 affi-F/GQs的自组装和表征 |
| 4.4.4 affi-F/GQs的临界胶束浓度(CMC)测定 |
| 4.4.5 affi-F/GQs的稳定性分析 |
| 4.4.6 Cur@affi-F/GQs的制备和表征 |
| 4.4.7 Cur@affi-F/GQs的体外药物释放 |
| 4.4.8 affi-F/GQs和Cur@affi-F/GQs的细胞摄取 |
| 4.4.9 affi-F/GQs和Cur@affi-F/GQs的细胞毒性和协同治疗 |
| 4.4.10 affi-F/GQs和Cur@affi-F/GQs抗癌机制探索 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
（9）血小板内皮粘附分子在脓毒症DIC中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 血浆sPECAM-1 水平与脓毒症DIC发生及预后的相关性研究 |
| 1.0 引言 |
| 2.0 材料 |
| 3.0 实验方法 |
| 4.0 结果 |
| 5.0 结论 |
| 第二部分 用CRISPR/Cas9 技术建立并鉴定PECAM-1 基因敲除小鼠 |
| 1.0 引言 |
| 2.0 材料 |
| 3.0 实验方法 |
| 4.0 结果 |
| 5.0 结论 |
| 第三部分 探究PECAM-1 在脓毒症DIC中的作用 |
| 1.0 引言 |
| 2.0 材料 |
| 3.0 实验方法 |
| 4.0 结果 |
| 5.0 结论 |
| 第四部分 探究PECAM-1 抑制脓毒症DIC的机制 |
| 1.0 引言 |
| 2.0 所用材料 |
| 3.0 实验方法 |
| 4.0 结果 |
| 5.0 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 脓毒症DIC病理机制及治疗研究进展 |
| 第一部分 脓毒症DIC病理机制研究进展 |
| 第二部分 脓毒症DIC治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间参与的基金课题和发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）生命科技伦理问题与治理策略——以人-动物嵌合体研究为例（论文提纲范文）
| 1 科学背景及其应用 |
| 2 伦理、社会争议 |
| 2.1 对嵌合体的“厌恶” |
| 2.2 对“非自然”的担忧 |
| 2.3 模糊物种间的界限 |
| 2.4 伦理地位的不确定 |
| 2.5 有损人性尊严 |
| 2.6 滑坡谬误 |
| 2.7 其他问题 |
| 3 生命科技伦理治理策略建议 |
| 3.1 法律与伦理规范层面 |
| 3.2 审查与监督管理层面 |
| 3.3 公众探讨与科学传播层面 |
| 4 结论 |
四、嵌合体动物技术研究进展（论文参考文献）
- [1]纷纭旋转之间:新兴技术回应型立法的舆论引导——以胚胎嵌合体为例[J]. 刘朝,左雨萌,寇鑫淼,闫昊宇. 科学与社会, 2021(03)
- [2]乌骨绵羊诱导多能干细胞的建立[D]. 刘默凝. 内蒙古农业大学, 2021
- [3]高亮度的单体化远红光与近红外藻胆蛋白荧光探针的研究[D]. 侯亚男. 华中农业大学, 2021(02)
- [4]丝氨酸蛋白酶抑制因子Spink7促进炎症消退的作用与机制探索 ——基于小鼠创面愈合与结肠炎模型的实验研究[D]. 赵娜. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [5]非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究[D]. 康宇. 昆明理工大学, 2020(04)
- [6]杆状病毒AcMNPV与家蚕二分浓核病毒嵌合体病毒的构建及其特性分析[D]. 孙伟娟. 江苏大学, 2020(02)
- [7]基于马属动物家系基因组研究异种杂交不相容的遗传基础[D]. 任秀娟. 内蒙古农业大学, 2020(01)
- [8]含寡聚脱氧氟尿苷的HER2靶向DNA纳米载体的构建及其抗肿瘤应用研究[D]. 张超. 河北大学, 2020(08)
- [9]血小板内皮粘附分子在脓毒症DIC中的作用及机制研究[D]. 罗丽丽. 华中科技大学, 2020(01)
- [10]生命科技伦理问题与治理策略——以人-动物嵌合体研究为例[J]. 彭耀进,李伟. 科技导报, 2020(05)